纳米化阿苯达唑对细粒棘球蚴原头节生长的影响

郭峰，董丹，陈聪哲，杨琨，侯隽，王仙，吴向未，陈雪玲*

（石河子大学医学院免疫学教研室，石河子 832000）

包虫病（hydatidosis，hydatid disease）又称为棘球蚴病，是细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus）的原头节感染人体及牛、绵羊等家畜所引起。包虫病是一种严重危害人体健康和畜牧业发展的人畜共患疾病，主要分布于牧区和半农牧区，是全球性的公共卫生问题，我国西部各省是该病高发区之一[1-2]。根治性手术仍然是包虫病的主要治疗手段，术前及术后均需化学药物辅助治疗。且因手术并发症常见、术后易复发及部分患者无法接受手术治疗等问题，药物治疗是一种较有效治疗方式。目前脂溶性苯并咪唑类中的阿苯达唑（ABZ）为棘球蚴病首选治疗药物之一，经长期药物治疗可显著延长术后病人寿命[3-4]。

阿苯达唑存在胃肠道吸收差，肝脏血药浓度低等缺点，使其药效受到限制。因此，提高阿苯达唑的临床疗效需增加药物的溶解度和生物利用率。纳米技术在医学领域不断发展和渗透，纳米材料的运载体为棘球蚴病的药物治疗开辟了新的思路。纳米药物载体将药物包封于亚微粒中或吸附于亚微粒表面，增加难溶药物的溶解度和生物利用率[5]、改变药物体内分布、提高药物安全性和临床疗效[6]。纳米药物载体技术将促进抗寄生虫药物加速发展，现研究尚处于初级阶段，具有广阔的发展前景[7-9]。

1 材料与方法

1.1 材料

RPMI 1640培养基，胎牛血清购自 Hyclone公司。DMSO，高效RIPA组织裂解液。NQO-1检测试剂盒购自武汉优尔生科技股份有限公司。药物由澳大利亚昆士兰大学顾文艺教授馈赠。

1.2 方法

1.2.1 细粒棘球蚴原头节的采集和培养

从新疆昌吉市屠宰场采集新鲜自然感染细粒棘球蚴病的绵羊肝脏，流水清洗干净肝脏，肝脏及包囊表面经75%酒精消毒，抽取无污染含有原头节囊液置于广口瓶中。静置5 min原头节自然沉淀后弃去多余囊液及较大残余囊皮，用含有100 IU/mL青霉素和100 IU/mL链霉素的 PBS漂洗原头节至澄清，用 0.1%伊红染色做染液排斥试验，检测活力（活力≥90%）。收集活性良好的原头节，加入适量含有10%胎牛血清和1%青霉素链霉素混合液的RPMI 1640培养液，37℃、5%CO2培养箱内培养，每2～3 d更换1次培养液，待用。

1.2.2 药物试验

实验分为 9组，空白对照组，3.13、6.25、12.5、25 μg/mL的纳米化阿苯达唑药物干预组及相同浓度阿苯达唑粉剂药物干预组。培养3 d后，PBS漂洗细粒棘球蚴原头节3次，每次3 min，各药物处理组培养板孔内分别加入相应药物及培养液，每处理组分别加入约3500个原头节样本。置于37℃、5%CO2培养箱中培养，培养过程中每3 d更换1次药物及培养液。

1.2.3 倒置显微镜观察原头节活力变化

移液器混匀各药物处理组样本，“十”字形抽取各处理组100 μL样本（约含原头节100个），离心后吸出多余培养液，转移原头节至载玻片，在倒置显微镜下观察经0.1%伊红染色后原头节形态及活力。活力良好的原头节拒染且结构较为饱满正常，死亡或活性较差的的原头节被伊红染液不同程度红染并可能观察到伴有结构破坏，计算各组死亡率，绘制活力曲线图。

1.2.4 原头节抗氧化酶活性检测

取取空白对照组、DMSO对照组、阿苯达唑粉剂处理组和纳米化阿苯达唑处理组（3.13、6.25、12.5、25 μg/mL）作用 3、6 d组的原头节，用 PBS漂洗 3次，每次3 min，加入RIPA裂解液，裂解原头节提取蛋白，4℃12000 g离心，转移上清液至EP管内，测定各处理组蛋白浓度并将各组所提蛋白的浓度配平。按照NQO-1检测试剂盒说明书方法检测各组原头节抗氧化酶活性。实验独立重复3次。

1.2.5 统计学分析

应用SPSS20.0软件进行统计学分析，均数间比较采用t检验，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药物作用对细粒棘球蚴原头节形态变化的影响

倒置显微镜下观察空白对照组原头节活动正常，伊红染色拒染不着色，虫体结构清晰完整。各用药组原头节活动减弱至死亡，虫体红染体积变小，发生皱缩，虫体外翻型增多，结构破坏。纳米化阿苯达唑组原头节的死亡率高于阿苯达唑粉剂组，且高浓度组形态改变较低浓度组虫体更明显。显微镜下原头节形态见图1。

图1 倒置显微镜下细粒棘球蚴原头节的形态 (100×)Fig.1 E.granulosus protoscoleces cultured with nano ABZ observed by inverted microscope(100×)

2.2 药物作用对细粒棘球蚴原头节活力的影响

空白对照组原头节活力在观察期内无明显变化。各浓度阿苯达唑粉剂和纳米化阿苯达唑处理组原头节活力与空白对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。根据活力曲线，纳米化阿苯达唑及阿苯达唑粉剂对原头节活性抑制作用呈现剂量及时间依赖性。各用药组原头节培养不同天数后活力曲线（图2）。

图2 不同浓度阿苯达唑作用后原头节的活力值Fig.2 Loss of viability of E.granulosus protoscolices during in vitro ABZ powder and nano ABZ treatment

2.3 阿苯达唑对细粒棘球蚴原头节氧化酶酶活性的影响

不同浓度纳米阿苯达唑处理原头节NQO-1酶活性检测结果见图3，酶活性呈现下降趋势，药物作用的原头节与空白组相比较差异均有统计学意义。

图3 纳米阿苯达唑在作用3d和6d后原头节NQO-1酶活性变化Fig.3 Effects of nano ABZ on NQO-1 activity in protoscoleces at 3 days and 6 days

3 讨论

细粒棘球蚴病是由细粒棘球蚴原头节引起的一种危害严重的人兽共患寄生虫病，呈全球性分布，牧区高发，治疗方式主要包括外科手术切除和化学药物治疗。目前，手术仍然是治疗棘球蚴病的最主要方式，但由于手术过程中原头节外溢难以避免、小部分外囊壁易残留等问题，术后复发率较高[10-12]。所以辅以术前术后药物治疗，对细粒棘球蚴病治疗具有重要意义。阿苯达唑又名丙硫苯咪唑，1975年研制合成，是临床上常用的治疗棘球蚴病的辅助药物[13]。

本研究观察了不同浓度纳米化阿苯达唑和普通阿苯达唑在体外对细粒棘球蚴原头节的作用。不同剂量组阿苯达唑在体外均对细粒棘球蚴原头节活力有抑制作用，细粒棘球蚴原头节的活力随着阿苯达唑浓度的增加呈现下降趋势，抑制作用呈剂量、时间依赖性，其中以25 μg/mL纳米化阿苯达唑组对原头节的杀伤作用更显著。药物作用与对照组的差别均具有统计学意义(P＜0.05)，进一步证实了该药在体外有一定的抗原头节作用。

普通阿苯达唑片剂、粉剂由于不溶于水和大部分有机溶剂，存在着溶解度低，肠道吸收差，血药浓度低等缺点[14]，阿苯达唑溶解性如有轻微的提高对于它的肠道吸收性以及肝血药浓度至关重要[15]。而纳米化阿苯达唑解决了阿苯达唑的难溶性缺陷，提高了阿苯达唑的溶解度，因此治疗棘球蚴病的效果更具优越性。本实验初步证实了纳米化阿苯达唑对原头节抑制作用优于阿苯达唑粉剂，有望成为理想的抗棘球蚴病药物。

体外试验具有简单易行、耗时短、易观察等优点，是初步观察抗棘球蚴病新药物治疗效果的有效手段，稳定、简便、有效的体外培养方法作为常规抗棘球蚴病药效学实验具有重要意义[16-17]。但因阿苯达唑在体内代谢过程较为复杂，纳米化阿苯达唑治疗效果还需疾病动物模型试验进一步验证。