实验红鲫C1HD系SNP标记的研究

朱丰 吴端生

[摘要] 目的 建立实验红鲫C1HD系的SNP标记。 方法 参照斑马鱼的SNPs基因库，设计SNP引物，采用单管双向等位基因专一性扩增（SB-ASA）方法，对12尾实验红鲫C1HD系和12尾实验红鲫封闭群的血液DNA样品进行SNPs基因分型并测序验证。 结果 zK261O7基因的zSNP30124211位点（G/A型）、zC227H20基因的zSNP24678043位点（A/T型）和zC39F23基因的zSNP26474328位点（G/C型）等3个SNPs位点能够准确辨别实验红鲫C1HD系和实验红鲫封闭群。 结论 zSNP30124211位点（G/A型）、zSNP24678043位点（A/T型）和zSNP26474328位点（G/C型）均可作为实验红鲫C1HD系的SNPs标记。

[关键词] 实验红鲫；C1HD系；单核苷酸多态性；单管双向等位基因专一性扩增

[中图分类号] Q95-33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）07（a）-0004-04

Establishment of SNPs markers of the laboratory red crucian carp C1HD strain

ZHU Feng1 WU Duansheng2

1.Endocrinology Division， the Affiliated Hospital of Jinggangshan University， Jiangxi Province， Ji′an 343009， China； 2.Department of Laboratory Animal Science，University of South China， Hu′nan Province， Hengyang 421001， China

[Abstract] Objective To establish SNP markers of the laboratory red crucian carp C1HD strain. Methods SNPs primers were designed referring to SNPs gene library of the Zebrafish， the SNPs were genotyped by single-tube bi-directional allele-specific amplification （SB-ASA） and were verified by sequencing for the laboratory red crucian carp C1HD strain. Results SNPs-PCR of blood DNA samples of laboratory red crucian carp could be genotyping of three sites Zk261O7 gene zSNP30124211 （G/A type）， zC227H20 gene zSNP24678043 （A/T type） and zC39F23 gene zSNP26474328（G/C type）. These three SNP markers were able to accurately identify the laboratory red crucian carp C1HD strain and the laboratory red crucian carp closed colony. Conclusion Three SNPs markers of Zk261O7 gene loci zSNP30124211 （G/A type）， zC227H20 gene loci zSNP24678043 （A/T type） and zC39F23 gene loci zSNP26474328（G/C type） could be used as SNPs markers in the laboratory red crucian carp.

[Key words] Laboratory red crucian carp； C1HD strain； Single nucleotide polymorphism； Single-tube bi-directional allele specific amplification

分布于我国长江流域的红鲫（Carassius auratus red variety）属鲫（Carassius auratus）的变种，它具有许多作为实验动物开发的优点[1]。本实验室培育出了实验红鲫C1HD系，是目前国内外唯一的一种实验红鲫近交系，可用于水生态毒理学等实验研究和环境安全性评价，本实验室已对它的一般生物学特性進行了研究[1-2]。实验红鲫C1HD系作为一种实验鱼类，应该建立它的遗传标记，以便用于对它进行遗传质量监测。

建立DNA分子遗传标记是目前实验动物培育及其遗传质量检测方法研究的发展方向[3-7]。早先，本实验室曾对实验红鲫C1HD系的随机扩增DNA多态性（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、微卫星多态性（SSR）等DNA分子标记进行过研究[8-9]。基于单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）标记具有快速、可靠、费用低以及高置信度的优点[3，10]和既往研究中对大小鼠SNP标记研究的成功经验[11-15]，本文也采用单管双向等位基因专一性扩增（single-tube bi-directional allele specific amplification，SB-ASA）方法来建立实验红鲫C1HD系的SNP标记，为编制实验红鲫C1HD系遗传质量控制标准提供技术参数。

1 材料与方法

1.1 实验鱼

普通级实验红鲫C1HD系，12尾，4年齡，平均体重41.2 g，设为A组。普通级实验红鲫封闭群，12尾，4年龄，平均体重45.6 g，设为B组；均由本实验室提供，随机取样。

1.2 主要试剂与仪器设备

蛋白酶K溶液（10 mg/mL），购自北京天根公司；琼脂糖（Agarose），Spanish分装；6×DNA loading buffer，购自碧云天公司；λ/HindⅢ、50 bp ladder、MarkerⅠ、1kb ladder plus等DNA Marker，购自北京天根公司；2×Taq PCR MasterMix，购自北京天根公司；引物，上海生工公司合成；多功能DNA纯化回收试剂盒，百泰克公司产品；pGEM-T Easy Vector System，购自Promega公司；T4 DNA Ligase，购自Fermentas公司；EcoR Ⅰ酶，购自Fermentas公司；大肠埃希菌JM109菌种，购自宝生物（大连）有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物，购自Oxoid公司。

-20℃冰箱，海尔公司产品；-80℃超低温冰箱，HARRIS公司产品；高速离心机，SORVALL公司产品；梯度PCR仪，Eppendorf公司产品；凝胶成像系统，Tanon公司产品。

1.3 基因组DNA的提取与检测

从实验红鲫尾静脉抽取全血，直接进行DNA提取，并置于-80℃超低温冰箱保存。基因组DNA的提取参照标准酚-氯仿抽提法进行[16]。用微量核酸蛋白检测仪结合0.7%琼脂糖凝胶电泳对DNA纯度和浓度进行检测。

1.4 引物设计

从斑马鱼SNPs数据库[17]和NCBI数据库dbSNP[18]随机选择若干个SNPs，利用Primer Premier 5.0软件，根据其位点两侧序列来设计引物P1、P2、MSP1、MSP2。其中引物MSP1、MSP2的3′端倒数第3位人为引入一个错配碱基，以增加SNP检测的精确性。经过筛选后，确认4种有效引物（表1）。

1.5 SNP-PCR检测

1.5.1 PCR反应 PCR反应体系总体积25 μL，依次加入：ddH2O，8 μL；2× Taq PCR Master Mix，12.5 μL；引物（20 μmol/L），各0.5 μL；特异性引物（20 μmol/L），各0.75 μL；DNA模板，2 μL。

PCR反应程序为：94℃（预变性），3 min，1个循环；94℃（变性），30 s；退火温度51.7～60.5℃，30 s，30个循环；72℃（延伸），1 min；72℃（延伸），5 min，1个循环。4℃保存。

1.5.2 电泳 将事先配置好的1.5%琼脂糖固体凝胶放入0.5×TBE电泳缓冲液的水平电泳槽中，PCR产物分别混合6×DNA loading buffer稀释至1×DNA loading buffer后分别加入琼脂糖凝胶点样孔，80 V电压下电泳50 min～1 h，在Tanon GIS system上观察、拍照。

1.6 PCR产物测序

采用多功能DNA纯化回收试剂盒，目的片段的纯化回收按试剂盒说明书进行。连接pGEM-T Easy Vector，以大肠埃希菌JM109细胞进行电转化。提取质粒DNA，酶切鉴定，菌液送上海生工基因有限公司测序。

2 结果

2.1 PCR检测结果

根据琼脂糖凝胶电泳图谱，以斑马鱼zSNP30124211等位基因（G/A型）设计的引物，在实验红鲫C1HD系中扩增出了314 bp的特异条带，基因型为G；而在实验红鲫封闭群中扩增出了153 bp的特异条带，基因型为A（图1）。以斑马鱼zSNP24678043等位基因（A/T型）设计的引物，在实验红鲫C1HD系中扩增出了289 bp的特异条带，属于基因型A；而在实验红鲫封闭群中扩增出了228 bp的特异条带，属于基因型T（图2）。以斑马鱼zSNP26474328等位基因（G/C型）设计的引物，在实验红鲫C1HD系中扩增出了141 bp的特异条带，属于基因型G；而在实验红鲫封闭群中扩增出了254 bp的特异条带，属于基因型C（图3）。以斑马鱼zSNP16713301等位基因（C/T型）设计的引物，在实验红鲫C1HD系和封闭群中均扩增出了1条311 bp大小的条带，属于基因型C；而在实验红鲫封闭群中还扩增出了226 bp的特异条带，属于基因型T（图4）。归纳起来，实验红鲫C1HD系和封闭群4个SNP等位基因位点的基因型见表2。

2.2 测序验证结果

对zK261O7基因zSNP30124211（G/A类型）、zC2-27H20基因zSNP24678043（A/T类型）和zC39F23基因zSNP26474328（G/C类型）等三个位点的基因序列测序的结果与SB-ASA方法检测的结果完全一致。

3 讨论

作为第三代DNA分子标记，SNP具有遗传稳定性高、位点丰富、分布广泛、适于快速、规模化筛查、易于估计等位基因频率和进行基因型确定等优点[3，10，19-20]。有研究表明，具有种群特异性的SNP标记是能够遗传的，故现在被当做常用的遗传标记研究对象[21]。Msalya等[22]就将SNP标记用于研究鉴别坦桑尼亚土著短角牛种群（TSZ）中的3个品系。其实，Petkov等[10]很早就将在SNP标记尝试用于实验小鼠的遗传检测。现在已逐渐将SNP标记广泛用于实验动物的遗传检测[3-5，7，12-15]。本文发现有3个SNPs位点，即zSNP30124211、zSNP24678043和zSNP26474328位点，可以准确区分实验红鲫C1HD系和实验红鲫封闭群，故可作为实验红鲫C1HD系的SNP标记。

关于SNPs检测的方法很多，如单链构象多态性（SSCP）、变性梯度凝胶电泳（DDGE）、酶切扩增多态性序列（CAPS）、等位基因特异性PCR（AS-PCR）等[23]。SB-ASA方法是姜正文等[11]在基于等位基因专一性PCR原理上发展起来的一种新的SNP分型方法，其原理是一个PCR反应体系包含两个3′末端分别与SNP两个等位基因特异结合的引物，它们延伸方向相反，产生长度不同的等位基因专一性扩增产物，同时在两个等位基因特异性引物的3′端第3位碱基引入不配对能够增加特异性。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后分析确定样本的基因型。这种方法后来应用在近交系小鼠和近交系大鼠的遗传检测上[12-15]，效果很好，可有效地鉴别近交系品系。本文也进一步证实SB-ASA方法是一项开展SNPs分型的有效的方法。该方法操作简便、快速，可同时测定三种SNPs等位基因类型，易于推广。值得注意的是，用SB-ASA方法进行PCR反应时，必须保证扩增全长片段的引物（内参引物）的变性温度Tm值和SNP位点特异性引物Tm值相差在3℃以内。在条件优化时，可通过改变引物的浓度比来达到最佳反应条件[24]。本文选择内参引物和特异性引物分别为0.4、0.6 μmol/L，是为最佳引物浓度。

[参考文献]

[1] 吴端生.实验红鲫标准化研究与应用的现状及展望[J].实验动物科学，2016，33（3）：56-30.

[2] 吴端生，王宗保，张轩杰.红鲫近交系的建立[J].中国实验动物学报，2001，9（2）：113-118.

[3] Fahey JR，Katoh H，Malcolm R，et al. The case for genetic monitoring of mice and rats used in biomedical research [J]. Mamm Genome，2013，24（3-4）：89-94.

[4] 孙芳园，王越甲，杨炜峰，等.大小鼠微卫星和SNP遗传检测的研究进展[J].实验动物科学，2014，31（3）：60-65.

[5] 徐伟，晁天柱，刘丽均，等.小鼠冷冻胚胎和精子SNP 遗传鉴定方法的建立[J].中国实验动物学报，2016，24（2）：169-174.

[6] 邹刚刚，陈永久，吴常文.SNP及其在鱼类养殖中的应用[J].浙江海洋学院学报：自然科学版，2012，31（5）：448-453.

[7] DB11/T 1053.3-2013 實验用鱼第3部分：遗传质量控制[S].北京市质量技术监督局，2013.

[8] 田智，吴端生，郑济芳，等.红鲫C1HD近交系RAPD标记的建立[J].中国比较医学杂志，2007，17（10）：589-591.

[9] 朱晓娟，董先辉，练高建，等.微卫星标记预警实验红鲫对苯酚遗传毒性响应的研究[J].实验动物科学，2013，30（2）：23-31，41.

[10] Petkov PM，Cassell MA，Sargent EE，et al. Development of a SNP genotying panel for genetic monitoring of the laboratory mouse [J]. Genomics，2004，83（5）：902-911.

[11] 姜正文，施锦绣，杨爽，等.单管双向等位基因专一性扩增的单核苷酸多态分型的新方法[J].中华医学遗传学杂志，2001，18（4）：306-309.

[12] 胡培丽.小鼠遗传检测方法的建立及生化标记位点的分子生物学研究[D].北京：中国药品生物制品检定所，2006.

[13] 胡培丽，范昌发，岳秉飞，等.单管双向等位基因专一性扩增方法在近交系小鼠遗传检测中的应用[J].中国实验动物学报，2006，14（4）：246-250.

[14] 胡培丽，范昌发，岳秉飞，等.4个近交系小鼠SNP位点的测定[J].中国比较医学杂志，2006，16（5）：278-280.

[15] 王淑菁.大鼠SNP遗传检测技术研究[D].北京：中国药品生物制品检定所，2011.

[16] Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T. Molecular cloning：a laboratory manual [M]. New York：Cold Spring Harbor Laboratory，1989.

[17] zBase.http：//dna.mc.vanderbilt.edu/zbase/

[18] dbSNP.http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/index.html

[19] 康静婷，梁前进.单核苷酸多态性的研究及其生物学意义[J].生物学通报，2012，47（3）：15-18.

[20] 唐立群，肖层林，王伟平.SNP分子标记的研究及其应用进展[J].中国农学通报，2012，28（12）：154-158.

[21] Bourke PM，Voorrips RE，Kraneburg T，et al. Integrating haplotype specifc linkage maps in tetraploid species using SNP markers [J]. Theor Appl Genet，2016，129：2211-2226.

[22] Msalya G，Kim ES，Laisser ELK，et al. Determination of genetic structure and signatures of selection in three strains of tanzania shorthorn zebu，boran and friesian cattle by genome-wide SNP analyses [J]. PLoS One，2017， 12（1）：1-8.

[23] 许家磊，王宇，后猛，等.SNP检测方法的研究进展[J].分子植物育种，2015，13（2）：475-482.

[24] 卜莹，古卓良，张晓丹，等.四引物PCR 扩增反应的单管SNP快速测定法[J].中国生物化学与分子生物学报，2004，20（2）：252-256

（收稿日期：2018-03-26 本文编辑：李岳泽）