拉曼光谱法在快速筛查紫杉醇脂质体制剂中的应用

赵瑜 尹利辉 胡昌勤

[摘要] 目的 应用拉曼光谱法建立定性鉴别模型，实现紫杉醇脂质体制剂的现场快速筛查。 方法 隔包装采集注射用紫杉醇脂质体的拉曼光谱，使用主成分分析（PCA）算法去除包装的干扰信号，提取紫杉醇脂质体的拉曼信号，用经典最小二乘（CLS）建立定性鉴别模型。对模型进行正向验证和反向验证确定判别的阈值，模型输出的相关系数值同阈值比较进行定性判定。使用外标法实现方法在三种仪器上的转移。 结果 排除玻璃包装的干扰提取的光谱与直接测量的光谱相关系数达0.9744，建立的紫杉醇脂质体定性模型，判断阈值为0.85，正向验证（脂质体制剂）和反向验证（脂质体膜成分和紫杉醇）结果均为通过。通过使用传递光谱和峰位检索，方法能够在便携式拉曼光谱仪、傅里叶拉曼光谱仪和显微成像拉曼光谱仪上实现转移。 结论 本研究所建立的快速筛查方法可满足抗癌类贵重药品的现场和实验室快速筛查，为监管和公安打假提供一种科学有效的手段。

[关键词] 拉曼光谱法；经典最小二乘算法；紫杉醇脂质体；假冒药品

[中图分类号] R927 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）07（a）-0024-06

Application of Raman spectroscopy on the rapid screening of paclitaxel liposome preparation

ZHAO Yu YIN Lihui HU Changqin

Institute for Chemical Drug Control， National Institutes of Food and Drug Control，Beijing 100050， China

[Abstract] Objective To realize the rapid screening on site， Raman spectroscopy was applied to establish an identification model of paclitaxel liposome preparation. Methods Raman spectra of the whole paclitaxel liposome product with package were first collected， and principal component analysis（PCA） algorithm was then used to extract paclitaxelliposome signals from the identified signals. Classic least squares（CLS） algorithm was used to established the identification model. The threshold was determined by the positive validation and negative challenge tests， and identification results would be get by compare the the correlation coefficients with the threshold. External standard method was utilized to realize the model transfer on three different kinds of Raman spectrometer. Results The correlation coefficient between the extracted spectrum and directly-measured spectrum was 0.9744. The paclitaxelliposome identification model was built with a threshold of 0.85， and results of both positive validation and negative challenge tests were all passed. Model transfer results also indicated that with the use of transfer spectra and peak search， the method established could be used on portable Raman， microscope imaging Raman and FT-Raman spectroscopes. Conclusion The Raman method established in this study could realize expensive anticarcinogen both on-site non-invasively and laboratory use， which can provide a scientific and efficient means for regulation and crackdown on counterfeit expensive medicine.

[Key words] Raman spectroscopy； Classic least squares algorithm； Paclitaxel liposome； Counterfeit medicines

公安機关公布的假药案件中，假冒抗癌类药物日渐猖獗。抗癌药物价格昂贵，近年来在亚洲和中东地区出现的假冒抗癌药物的数量呈上升趋势，国际药物安全研究所2016年公布的数据显示，抗癌药制假造假的增长率为29%，高居第四位[1]。

紫杉醇为天然提取或半合成制备的化学抗肿瘤药，在水中几乎不溶，在甲醇、乙醇、三氯甲烷中溶解[2]。紫杉醇注射液配方中用高浓度的乙醇作为助溶剂，因此需要特殊的输液装置，用很低的滴注速度。由于注射后患者极易出现过敏反应，因此给药时为防止发生严重过敏反应常使用地塞米松、抗组胺药或H2受体拮抗剂等同时进行预防给药，使紫杉醇在临床上的应用受到了很大程度的限制。紫杉醇脂质体是将紫杉醇包裹在磷脂膜材料中，使药物具有靶向性，避免了高浓度乙醇对患者注射的刺激性，明显降低紫杉醇的过敏反应、毒性，在临床使用上具有明显优势[3]。紫杉醇脂质体制剂的价格昂贵，进口产品要上万元1支，南京绿叶思科药业有限公司生产的力扑素（注射用紫杉醇脂质体）售价也在千元左右，是名副其实的贵重药品。

中国药典2015版收录拉曼方法为药典方法[4]。使用拉曼光谱法定性鉴别的传统方式为采集纯物质光谱，与对照品的拉曼光谱或标准谱图集比对的方法。但对于药物制剂，除了无辅料的注射用粉针和配方单一的注射液外[5]，样品通常为混合物，采集的制剂拉曼光谱很难直接通过比对的方法进行定性鉴别。而使用化学计量学方法可以对混合信号进行分离[6]，通过计算的输出值同阈值比较，给出定性结果，从而实现制剂的鉴别甚至是无损检测[7-8]。本研究开展紫杉醇固体脂质体制剂的拉曼光谱定性方法研究，使用化学计量学方法建立固体脂质体制剂的快速筛查方法，并进一步进行模型转移研究，提高方法的实用性和适用性，为打击假冒贵重抗癌药品提供一种科学有效的监管手段。

1 材料与方法

1.1 材料

Metage OPAL-3000型便携式拉曼光谱仪（Metage Scientific， Banbury，UK），采用光纤测量方式，探头焦距5 mm，激发光源785 nm，分辨率4.5 cm-1，光谱范围200～3000 cm-1，CCD检测器，工作温度-50℃。特殊设计样品仓，可同时确保不同包装的液体注射剂测量时处于探头的焦点和完全避光环境。软件RFDI2015 （version 3.00），用于光谱的采集和模型的建立。

方法转移验证用仪器：Bruker E55-FRA型傅里叶拉曼光谱仪，激发光源1064 nm，分辨率0.5 cm-1，光谱范围50～3500 cm-1；Thermo DXR-image型显微成像拉曼光谱仪，激发波长785nm，分辨率4 cm-1，光谱范围50～3300 cm-1。

标准物质：紫杉醇对照品，中国食品药品检定研究院，批号：100382-201102；磷脂酰胆碱，中国食品药品检定研究院，批号：190064-201301；大豆磷脂酰胆碱，中国食品药品检定研究院，批号190002-201603；蛋黄磷脂酰胆碱，中国食品药品检定研究院，批号：190005-201602；鞘磷脂，中国食品药品检定研究院，批号：190023-201603；胆固醇，中国食品药品检定研究院，批号：111618-200301。

紫杉醇脂质体制剂样品：注射用紫杉醇脂质体，南京绿叶制药有限公司，30 mg，批号：216090209。

1.2 方法

1.2.1 处方研究 根据产品说明书，力扑素脂质体组成包括：紫杉醇、卵磷脂、胆固醇、苏氨酸、葡萄糖，其中卵磷脂和胆固醇是脂质体膜的组成部分。胆固醇的作用是增加脂质体膜的刚性[9]，一般添加量占30%左右；卵磷脂的主要成分是磷脂酰胆碱。除磷脂酰胆碱，本研究还对大豆磷脂酰胆碱、蛋黄磷脂酰胆碱、鞘磷脂等其他脂质体辅料进行了研究，并作为反向挑战样品对模型进行验证。

1.2.2 拉曼光谱采集 拉曼光谱仪测样前需校正（基线偏移量、x轴准确度、y轴准确度）及自检[10]，自检性能指标通过才能进行样品拉曼光谱的采集。便携式拉曼光谱测试条件：分辨率4.5 cm-1，光谱范围200～3000 cm-1，积分时间5 s，累加次数10次，激光输出功率为100 mW；傅里叶拉曼光谱仪测试条件：分辨率4 cm-1，光谱范围50～3500 cm-1，积分时间60 s，累加次数10次，激光输出功率为50 mW；显微成像拉曼光谱仪测试条件：分辨率4 cm-1，光谱范围50～3300 cm-1，20倍物镜，积分时间5 s，累加4次，激光输出功率20 mW。

1.2.3 模型建立 谱图预处理方法采用一阶导数，25点平滑。使用紫杉醇对照品、脂质体辅料对照品的拉曼光谱作为目标光谱，使用PCA提取的多种玻璃主成分光谱作为干扰光谱，按照CLS（经典最小二乘）原理建立定性鉴别模型。将从隔包装测量的拉曼光谱（紫杉醇脂质体和玻璃的混合拉曼信号）中提取紫杉醇脂质体信号，与目标光谱比较，进行定性鉴别。具体做法为通过模型计算拟合出样品中紫杉醇脂质体的光谱图，计算其与紫杉醇与脂质体辅料的加和标准光谱的相关系数R，作为定性判别的指标。用收集的紫杉醇脂质体样品作为正向验证，用紫杉醇对照品、空白脂质体组成辅料以及其他脂质体辅料作为反向验证，用于阈值的确定和模型验证。如果相关系数大于阈值则定性结果为“是”，否则为“否”。

1.2.4 方法转移 对便携式拉曼光谱仪、显微成像拉曼光谱仪以及傅里叶拉曼光谱仪都使用从包装中取出制样的方法进行测量。使用泰诺林作为标准固体样品[11]，采用外标法，分别在便携式拉曼光谱仪、傅里叶拉曼光谱仪、显微成像拉曼光谱仪上采集拉曼光谱，以便携式拉曼光谱仪的光谱为基准，计算后两者的传递光谱作为输入模型计算的光谱[12]。

2 结果

2.1 脂质体膜成分的拉曼光谱

注射用紫杉醇脂质体样品装量约为1.17 g，根据紫杉醇标示量30 mg，则紫杉醇含量约为2.6%（w/w），说明脂质体制剂的主要组成部分是脂质体膜的组成物质：卵磷脂和胆固醇。胆固醇的拉曼光谱2933、2268、1672、1439、700 cm-1处有强的特征峰（图1A）。卵磷脂的拉曼光谱在2885、2851、1737、1659、1440、1298、1093、1064、712 cm-1處有较强特征峰（图1B）。

磷脂酰胆碱、大豆磷脂酰胆碱、蛋黄磷脂酰胆碱的拉曼光谱特征峰基本一致，仅在1000～1100 cm-1处峰存在差异（图1B、图2A～B）。鞘磷脂的拉曼光谱与卵磷脂的拉曼光谱差异明显，如2700～3000 cm-1、1600～1700 cm-1以及1000～1200 cm-1范围内均存在差异（图2C）。

2.2 无损测量信号提取

本文对采集的注射用紫杉醇脂质体样品隔瓶测量的拉曼光谱，一阶导数光谱预处理，使用PCA-CLS方法拟合，消除玻璃包装的干扰，提取得到的紫杉醇脂质体拉曼光谱（图3A），峰位清晰，与直接测量的紫杉醇脂质体光谱（图3B）在500～2000 cm-1范围内相关系数达0.9744。

2.3 紫杉醇脂质体定性模型

对比紫杉醇脂质体、紫杉醇、空白脂质体（胆固醇和磷脂酰胆碱）的拉曼峰位（图4），紫杉醇脂质体的拉曼光谱中仅有1123 cm-1处峰无干扰，为紫杉醇特征峰，其余峰位处紫杉醇的特征峰和空白脂质体（胆固醇和磷脂酰胆碱）的特征峰多有重叠现象，因此无法使用传统的谱图对照法对紫杉醇和脂质体的特征峰一一比对实现定性鉴别。

因此，本研究使用CLS算法，将脂质体制剂中的紫杉醇、卵磷脂和胆固醇作为参考目标光谱，建立注射用紫杉醇脂质体的无损定性鉴别模型，其中，计算谱区600～1200 cm-1很好的利用了三者的指纹图谱，大大提高了模型的辨识度；根据经验初步设定阈值为0.85，此阈值可根据模型验证结果进行调整。

2.4 模型的验证

使用注射用紫杉醇脂质体样品作为正向验证、脂质体组成成分（磷脂酰胆碱、大豆磷脂酰胆碱、蛋黄磷脂酰胆碱、鞘磷脂、胆固醇）和紫杉醇作为反向验证，对定性鉴别模型进行验证，模型输出的相关系数R值见表1。0.85作为定性判别的阈值，能区分正向验证和反向验证的样品，得到正确的鉴别结果。

2.5 方法转移

便携式拉曼光谱仪、显微成像拉曼光谱仪以及傅里叶拉曼光谱仪的测量的拉曼光谱特征峰位基本一致（图5），但相对峰强度存在差异。光谱直接代入紫杉醇脂质体模型，输出值分别为0.9043（图5A）、0.7997（图5B）和0.8531（图5C），显然显微成像拉曼光谱（图5B）的结果超出了模型的判断阈值，无法得到有效的判断。使用计算的传递光谱代入紫杉醇脂质体模型，输出值分别为0.9393（图5A）、0.8832（图5B）和0.9025（图5C），使用阈值0.85可以实现有效的定性鉴别，有效的提高了定性判别的准确性，实现了方法的转移。

3 讨论

磷脂酰胆碱、卵磷脂、大豆磷脂酰胆碱和蛋黄磷脂酰胆碱都是制备脂质体常用的磷脂材料，其主要区别在于来源不同、磷脂酰胆碱的含量不同：卵磷脂是由其他磷脂提纯获得的颗粒及粉末，磷脂酰胆碱含量可达95%以上；大豆磷脂酰胆碱取自大豆压榨豆油以后的豆渣和豆饼，磷脂酰胆碱含量约占22%；蛋黄卵磷脂取自动物胚胎或鸡蛋蛋黄，磷脂酰胆碱含量约占73%[13]。鞘磷脂也是一种常用的脂质体辅料，它是一种由神经酰胺的C-1羟基上连接了磷酸胆碱（或磷酸乙醇胺）构成的鞘脂，鞘磷脂是动物细胞膜及其他各种生物膜的主要组成部分，其取之于高等动物，如人血浆中就含有丰富的鞘磷脂[13]。由此可见，各种磷脂不仅在结构上相似，而且成分亦有重叠，本研究考察了它们光谱上的异同程度；同时将4种磷脂材料作为定性鉴别反向验证的挑战样品，一方面确定了判定阈值，另一方面验证了方法的准确性。

本文所建的定性模型是基于长焦距光纤探头配置的便携式拉曼光谱仪建立的无损检测方法，使用时可隔玻璃包装采集拉曼光谱，有效的鉴别紫杉醇脂质体。显微成像拉曼和傅里叶拉曼受聚焦模式的限制，无法实现隔包装的有效测量，需取样品制样后测量。值得注意的是，本文所建模型对从包装中取出样品进行测量的方式同样适用，而无需更改模型参数。这是因为模型的对干扰光谱的计算采用过滤的方式，当没有玻璃信号干扰时，计算得到的玻璃贡献的权重值为很小，接近于零。

不同原理的拉曼光谱仪，使用的硬件（如激光器、聚焦系统、分光系统、检测器等）不同，仪器原理和硬件上的差异会引起固体样品的散射信号中物理信号的差异，反映在拉曼光谱上即相对峰强度的差异。这些差异在使用快速筛查方法进行计算时会影响输出的相关系数值，进而影响方法的准确性。因此对于便携式拉曼光谱仪、显微成像拉曼光谱仪和傅里叶拉曼光谱仪，相对峰强度的统一是实现方法转移的关键。本研究通过方法转移，使建立的快速筛查方法具有更广泛的适用性，增加了方法的应用范围，可满足不同情况的监管需求。

综上所述，本文所建立的拉曼光谱方法能够实现紫杉醇固体脂质体制剂的快速筛查，方法对注射用紫杉醇脂质体进行的定性鉴别直接输出判定结果，而无需谱图解析，对使用人员要求低，实用性强。使用长焦距光纤探头的便携式拉曼光谱仪可直接用于抗癌类贵重药品的隔包装检测，简单快速，结果可靠，尤其适合贵重药品和现场检测。方法亦可转移到实验室用多种拉曼光谱仪上使用，实现定性鉴别。因此，本文所建的方法为一种通用的紫杉醇脂质体制剂快速筛查手段，具有广泛的适用性和较高的实用性，能为抗癌类贵重药品的监管和公安打假提供一种简便、可行、科学的方法。

志谢：感谢江苏省食品药品监督检验研究院范青峰主任为本研究提供样品。

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（收稿日期：2018-01-25 本文编辑：李岳泽）