白肋烟、晒烟和烤烟烟叶在6年贮藏过程中主要酮类香气成分的变化趋势

张梦玥，史宏志，毕艳玖，刘百战，周骏，段卫东

1 河南农业大学 国家烟草栽培生理生化研究基地/烟草行业烟草栽培重点实验室，郑州，450002；

2 上海烟草集团有限责任公司 烟草行业卷烟烟气重点实验室，上海，200082；

3 河南中烟工业有限责任公司，郑州，450000

烟草香味是衡量和评价烟草质量的重要指标[1],是多种具有特定香气特征的香气成分共同作用的结果。烟草挥发性致香物质含量与种类直接决定烟草的香气[2-3]，其中酮类香味物质是烟草中重要的致香物质，其与感官质量的相关性非常高[4-8]，不同酮类物质对烟叶香气特征及其对香味的贡献不同，但都对卷烟的吸味、满足感等有较强影响, 可赋予烟叶干草样甜香、可可香、花香、木香等，使烟气舒适，并改善侧流烟气香气[9-11]，酮类成分也是卷烟加香中的主要物质[12-14]。

烟草贮藏是借助自然气候的变化，利用季节性温度上升，促进烟叶内酶的活动及氧化作用等，促使烟叶缓慢发酵的过程，该过程可促进烟叶内在化学成分转化，使青杂气和剌激性下降，烟叶香气透发、烟气醇和细腻，同时改善余味、增强燃烧性[15-16]。贮藏期间烟叶主要香气成分含量变化较大; 随着贮藏时间的延长，烟叶中大多数香气物质的含量有所增加，尤其是低分子量的成分更为明显，香味成分在贮藏前期缓慢增加并达到最大值，后期开始下降[10,17-22]。一般该过程进行2～3年为最佳，但在实际生产中烟叶的贮藏时间多在5年以上。

目前国内研究多集中在生态、栽培等方面对致香物质以及不同的贮藏环境对烟叶化学成分、物理变化的影响等[23-32]。本试验通过在烤烟、白肋烟和晒烟6年贮藏过程中定期取样，分析了烟叶中主要挥发性酮类香气物质含量，以及长期贮藏过程中不同类型烟叶主要酮类香气物质含量的变化趋势，以期为烟叶合理贮藏和有效利用，提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料与样品制备

供试材料取自各类型烟叶典型产区，具体信息见表1。

取调制后的每个类型和产地烟叶10kg。烟叶去除主脉后，剪成3～5cm2大小的碎片，充分混匀，2011年12月第一次取样后自然贮藏，每隔128天取样1次，每次取样50g，分别进行冷冻干燥，最后一次取样完成后将全部样品取出磨粉，过60目筛，统一进行样品主要酮类香气成分含量的测定,每样品重复测3次。

表1 供试材料基本信息表Tab.1 Basic information for test materials

1.2 仪器与试剂

α-紫罗兰酮内标溶液购置于Accustandard公司（New Haven, CT, USA），用正己烷稀释内标溶液至11.2μg /mL待用；正己烷、叔丁基甲醚购置于Tedia公司（Fairfield, OH, USA）；震荡使用Vortex-Genie2多功能旋涡混合器，购置于Scientific Industries公司（USA）；HPLC使用Agilent1290购置于Agilent公司（Palo Alto, CA, USA）; GC/MS 使用Agilent5975购置于Agilent公司（Palo Alto, CA, USA）。

1.3 测定方法

采用上海烟草集团技术中心改进的正己烷常温萃取前处理方法和LC-GC方法[33]测定烟草中主要酮类香气成分含量。

1.3.1 烟叶样品前处理

称取0.2g烟末并放入20mL螺口试管中，加入5mL正己烷和叔丁基甲醚混合溶剂（1：1），然后加入200µL α-紫罗兰酮（11.2μg /mL）内标溶液，静置24h，在旋涡混合器上每分钟200转震荡1分钟，3000转离心10min，取1～2 mL上清液至色谱样品瓶。

1.3.2 HPLC条件

Waters Styragel HR0.5凝胶色谱柱（30cm×4.6cm i.d., 5m），流动相二氯甲烷，流速0.25mL/min，进样量20µL，柱温箱30℃。DAD检测波长238nm、254nm和320nm。

1.3.3 GC/MS条件

色 谱 柱 DB-5MS（30m×0.25mm i.d., 0.25m df），炉温箱初始温度40℃保持14min，以4℃/min升至290℃，保持5min。GC/MS传输线温度280℃，MS离子源温度230℃，四极杆温度170℃，质量范围45～350amu。质谱采用NIST98和WILEY6.0谱库并联检索定性，假定相对校正因子为1，采用内标法定量。

1.3.4 接口条件

参考中国发明专利《高效液相色谱与气相色谱/质谱联用的接口装置》[34]。

1.4 数据分析

采用Excel2007进行基础数据处理和绘图。运用SPSS 20.0进行统计分析。

2 结果与分析

白肋烟、晒烟和烤烟烟叶样品在6年贮藏过程中主要酮类香气成分的初始值，最终值和最大值见表2。

rage表acco during sto总据数分成气香类 贮ponents content of d ifferent types of tob酮要主中程过藏品样叶烟型类同2 不ain ketone aroma com表hanges in m Tab.2 C烟烤南河 烟烤南云 烟肋白南云 烟肋白川四 烟晒川四/值·g-1大μg最/值·g-1终μg最/始μg·g-1值 初/大μg·g-1值 最/终μg·g-1值 最/始μg·g-1值 初/大μg·g-1值 最/终μg·g-1值 最/始μg·g-1值 初/大μg·g-1值 最/终μg·g-1值 最/始μg·g-1值 初/值·g-1大μg最/值·g-1终μg最1.3140.7254 0.73 1.0930.3840.7521.4811.0520.7867 1.77 1.5281.2581.9851.9058.4965.7726 3.68 8.2545.8683.7769.8287.6373.58814.484 53.0 11 7.682.948 12 11.279 7.6195.3777 3.06 6.9095.3101.9063.5912.2911.2943 2.73 1.9661.5123.0552.0711.5871.2416 0.76 1.7621.3540.9721.4331.3320.9310 2.06 2.0041.3291.8611.8330.7290.6009 0.72 0.7230.5660.7230.7660.6330.7664 0.80 0.6880.8040.8970.7800.8550.3254 0.28 0.8190.4690.2552.1912.1440.8727 2.06 1.9551.5951.8041.7085.4172.8821 1.92 5.3292.9051.56865 15.6.608 15 6.19314.870 14.442 11.546.809 10 10.216 1.3680.9155 0.59 1.2030.8380.3611.7461.4430.7738 1.58 1.3601.1461.3791.0605.7012.5141 1.70 5.1712.5851.55714.711.064 14 6.36412.967 12.967 9.3489.8939.8933.6861.6626 3.68 3.9561.8063.9266.5673.5346.5676 5.72 4.0385.7264.7463.4230.3460.1986 0.34 0.6220.4430.6060.1980.0550.1980.1190.0200.1190.2890.093始g·g-1值初/μ1.5698.2121.3991.3740.7950.7184.9520.6054.0244.7460.285分成气香类酮酮丙基叶香酯内桃猴猕氢二氢二-酮-β基大马羟3-酮兰罗紫化氧酮兰罗紫β-1酮烯三豆巨2酮烯三豆巨3酮烯三豆巨4酮烯三豆巨酮茄酮二茄降要主胡类萝卜素降解酮类成分 柏烷 类成类降解酮分西

2.1 烟草贮藏过程中类胡萝卜素降解酮类成分含量的变化

2.1.1 香叶基丙酮含量的变化

6年自然贮藏期间香叶基丙酮含量动态变化规律如表2。由表可看出，不同类型烟叶样品间差异显著，晒烟烟叶样品的香叶基丙酮含量最高，其次为两种白肋烟，烤烟烟叶样品的含量最低。同类型烟叶中，四川白肋烟香叶基丙酮含量高于云南白肋烟，云南烤烟含量低于河南烤烟。随贮藏时间的增加，3种类型烟叶样品香叶基丙酮含量均呈现出先上升后下降的趋势。烤烟下降趋势明显，其次为白肋烟，晒烟上升趋势较下降趋势更为明显。3种类型烟叶样品模拟方程决定系数均达0.70以上，拟合程度较高。

表3 不同类型烟叶样品贮藏过程中香叶基丙酮含量的变化Tab.3 Changes in Geranylacetone content of different types of tobacco during storage

2.1.2 二氢猕猴桃内酯含量的变化

从不同类型烟叶样品6年自然贮藏期间二氢猕猴桃内酯含量变化（表3）可看出，四川晒烟二氢猕猴桃内酯含量前期多于四川白肋烟，后期相反；两者二氢猕猴桃内酯含量均显著大于云南白肋烟以及两种烤烟样品。同地区不同类型烟叶二氢猕猴桃内酯含量接近。同种类型烟叶间，四川白肋烟二氢猕猴桃内酯含量显著大于云南白肋烟,河南烤烟则大于云南烤烟。随贮藏时间增加，3种类型烟叶二氢猕猴桃内酯含量均呈现出先增加后降低的趋势。晒烟于36个月达到高点，白肋烟和烤烟分别于50、43个月达到最高点。

表4 不同类型烟叶样品贮藏过程中二氢猕猴桃内酯含量的变化Tab.4 Changes in Dihydroactinidiolide content of different types of tobacco during storage

2.1.3 3-羟基-β-二氢大马酮含量的变化

从3-羟基-β-二氢大马酮含量的测定结果（表5）可以看出，烤烟烟叶样品中3-羟基-β-二氢大马酮含量最高，晒烟与白肋烟烟叶样品3-羟基-β-二氢大马酮含量无显著差异。同类型烟叶中，河南烤烟 3-羟基-β-二氢大马酮含量显著大于云南烤烟,云南白肋烟大于四川白肋烟,。从表中可以看出，3种类型烟叶3-羟基-β-二氢大马酮含量随贮藏时间增加呈现出先增加后降低的趋势，均于前4年增幅较大，且烤烟中该趋势更明显。

表5 不同类型烟叶样品贮藏过程中3-羟基-β-二氢大马酮含量的变化Tab.5 Changes in 3-OH-damasone content of different types of tobacco during storage

2.1.4 氧化紫罗兰酮含量的变化

从不同类型烟叶样品自然贮藏期间氧化紫罗兰酮含量变化中（表6）可看出，不同类型烟叶样品间氧化紫罗兰酮含量无显著差异。同类型烟叶样品中，四川白肋烟显著大于云南白肋烟，两种烤烟无显著差异。白肋烟、晒烟中氧化紫罗兰酮含量随时间的增长逐渐升高，而烤烟则呈现出先上升后下降的趋势，并于35至40个月之间出现拐点。3种类型烟叶样品氧化紫罗兰酮含量一元二次模型的决定系数均为0.78以上，拟合程度较高。

表6 不同类型烟叶样品贮藏过程中氧化紫罗兰酮含量的变化Tab.6 Changes in Ionone oxide content of different types of tobacco during storage

2.1.5 β-紫罗兰酮含量的变化

从不同类型烟叶样品经自然贮藏后β-紫罗兰酮含量变化（表7）可看出，四川晒烟β-紫罗兰酮含量高于白肋烟，且均高于烤烟烟叶样品。同一类型烟叶样品中，四川白肋烟β-紫罗兰酮含量大于云南白肋烟，河南烤烟大于云南烤烟。随时间增加，四川晒烟含量先升高后降低，白肋烟和烤烟呈现出降低趋势。5种样品的变化趋势均与模拟的一元二次方程极显著相关。

表7 不同类型烟叶样品贮藏过程中β-紫罗兰酮含量的变化Tab.7 Changes in beta-Ionone content of different types of tobacco during storage

2.1.6 贮藏过程中巨豆三烯酮含量的变化

2.1.6.1 巨豆三烯酮1

从不同类型烟叶样品6年自然贮藏期间巨豆三烯酮1含量变化（表8）可以看出，不同类型烟叶样品间巨豆三烯酮1含量差异显著，白肋烟烟叶样品含量高于晒烟，且两者均高于烤烟烟叶样品。同种类型间，四川白肋烟巨豆三烯酮1初始含量高于云南白肋烟，而贮藏过程中云南白肋烟含量显著上升。3种类型烟叶样品巨豆三烯酮1含量均先增加后减少，烤烟出现拐点的时间较白肋烟与晒烟更短，于35个月附近含量出现下降趋势，白肋烟、晒烟于55个月左右稍有降低。

表8 不同类型烟叶样品贮藏过程中巨豆三烯酮1含量的变化Tab.8 Changes in Meg1 content of different types of tobacco during storage

2.1.6.2 巨豆三烯酮2

从不同类型烟叶样品6年自然贮藏期间巨豆三烯酮2含量变化（表9）可以看出，不同类型烟叶样品巨豆三烯酮2含量有显著差异。白肋烟烟叶样品含量最高，其次是晒烟，烤烟烟叶样品中巨豆三烯酮2含量最低。白肋烟与晒烟巨豆三烯酮2含量逐渐上升，烤烟呈现先上升后下降的趋势。云南白肋烟初始含量较低但上升幅度大于四川白肋烟。两地区烤烟巨豆三烯酮2含量相近。5种烟叶一元二次曲线模型的拟合程度均达到极显著水平 。

表9 不同类型烟叶样品贮藏过程中巨豆三烯酮2含量的变化Tab.9 Changes in Meg2 content of different types of tobacco during storage

2.1.6.3 巨豆三烯酮3

从不同类型烟叶样品在自然贮藏条件下巨豆三烯酮3含量变化（表10）中可以看出，白肋烟烟叶样品巨豆三烯酮3含量高于晒烟和烤烟，晒烟与烤烟烟叶样品含量差异不显著。同种类型间，四川白肋烟巨豆三烯酮3初始含量大于云南白肋烟，而贮藏过程中云南白肋烟升高程度明显。河南烤烟巨豆三烯酮3含量大于云南烤烟。3种类型烟叶巨豆三烯酮3含量均先增加后减少，具体趋势与巨豆三烯酮1相似。

表10 不同类型烟叶样品贮藏过程中巨豆三烯酮3含量的变化Tab.10 Changes in Meg3 content of different types of tobacco during storage

2.1.6.4 巨豆三烯酮4

从不同类型烟叶样品6年自然贮藏期间巨豆三烯酮4含量变化（表11）可看出，白肋烟烟叶样品巨豆三烯酮4含量大于晒烟，烤烟烟叶样品含量最低。两地区白肋烟于贮藏过程中的变化规律与巨豆三烯酮1相似。白肋烟与晒烟巨豆三烯酮4含量随时间增加而逐渐升高，烤烟呈现出先增加后降低的趋势，且在35个月左右含量达到峰值。

表11 不同类型烟叶样品贮藏过程中巨豆三烯酮4含量的变化Tab.11 Changes in Meg4 content of different types of tobacco during storage

2.2 烟草贮藏过程中西柏烷类降解酮类成分含量的变化

2.2.1 贮藏过程中茄酮含量的变化

从不同类型烟叶样品6年自然贮藏期间茄酮含量变化（表12）可看出，不同类型间，白肋烟烟叶样品茄酮含量大于晒烟，两者均大于烤烟烟叶样品。同种类型烟叶样品茄酮含量差异不显著，清香型和浓香型烤烟并无显著差异。3种类型烟叶茄酮含量于贮藏前期表现出下降趋势，后期白肋烟与晒烟后期含量变化趋于平稳，烤烟则呈现持续下降趋势。

表12 不同类型烟叶样品贮藏过程中茄酮含量的变化Tab.12 Changes in Solanone content of different types of tobacco during storage

2.2.2 贮藏过程中降茄二酮含量的变化

从不同类型烟叶样品6年贮藏期间降茄二酮含量变化（表13）中可看出，烤烟烟叶样品中降茄二酮平均含量为0.400 μg/g ，显著大于晒烟烟叶样品，两者均大于白肋烟。同一类型间，云南烤烟降茄二酮含量显著大于河南烤烟,云南白肋烟含量显著大于四川白肋烟。贮藏过程中，5种烟叶样品中降茄二酮含量均随时间增加而逐渐降低，其中晒烟的降低趋势更明显。降茄二酮含量变化经拟合二次曲线模型决定系数均达到0.93以上，拟合程度较高。

表13 不同类型烟叶样品贮藏过程中降茄二酮含量的变化Tab.13 Changes in Norsolandione content of different types of tobacco during storage

2.3 烟草贮藏过程中酮类香气物质总量的变化

从不同类型烟叶样品6年贮藏期间酮类香气物质总量变化（表14）中可看出，白肋烟烟叶样品含量最高，贮藏期间所有阶段平均值为46.251 μg/g，其次是晒烟，平均值为40.053 μg/g，烤烟烟叶样品贮藏期间所有阶段平均值为26.306 μg/g，显著低于前两者。同一类型间，四川白肋烟含量初始值较高，但云南白肋烟增加量更多。贮藏过程中，5种样品中酮类香气物质总量均随时间增加先升高后降低，烤烟呈现降低趋势的时间更短，只有38个月。酮类香气物质总量变化经拟合二次曲线模型决定系数均达到0.87以上，与该模型拟合程度达到极显著水平。

表14 不同类型烟叶样品贮藏过程中酮类香气物质总量的变化Tab.14 Changes in total ketones content of different types of tobacco during storage

3 讨论

烟叶的香气质、香气量和香型风格是由多种香气成分的组成、含量、比例及其相互作用所决定的[35]，前人研究认为，不同烟草类型在致香成分组成上具有一定的相似性，但相互间烟叶的香气质和香气量差异很大[36]，不同类型烟叶表现出不同的香吃味质量和风格可能是由其致香物质的含量、种类存在差异性造成的[37]，与本实验三种类型烟草样品致香物质含量差异较大的研究结果相符，如白肋烟烟叶样品巨豆三烯酮4的平均含量为11.131μg/g，比烤烟烟叶样品的3.299μg/g 高2.374倍。

不同烟草类型或相同类型不同品种在不同的生态环境和栽培条件下，其中性香气成分的组成、状态、含量和比例不尽相同，因此表现出不同的香气类型，并对烟草品质和风格的形成造成一定的影响[2,38]。本文中四川与云南两地的白肋烟致香成分含量有所差异。两地区白肋烟中氧化紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯含量差异较大，其中四川白肋烟二氢猕猴桃内酯含量较云南白肋烟高出50.96%。从四种巨豆三烯酮变化情况可看出，贮藏前云南白肋烟巨豆三烯酮含量较低，贮藏过程中增长快，该现象可能与云南白肋烟产区空气湿度低，烟叶调制过程失水快，调制期短，类胡萝卜素的降解不充分，大量类胡萝卜素在贮藏期继续转化有关[39]。多种香气物质，如巨豆三烯酮、二氢猕猴桃内酯、氧化紫罗兰酮等在贮藏过程中呈现出先升高后降低的趋势，可能由于在前期的贮藏过程中香气前体物质继续降解，使降解产物增加，后期前体物质减少，香气物质挥发或降解量大于生成量，故含量逐渐降低，该趋势与赵铭钦[40]等人的研究结果相符。在贮藏过程中β-紫罗兰酮含量降低与其可进一步转化为β-二氢大马酮和β-大马酮有关[41]，茄酮氧化降解为降茄二酮导致含量下降[42]，降茄二酮可以被氧化生成双环氧化合物，也可以被还原、重排、最后生成六氢吡喃的衍生物[9]，在贮藏过程中含量持续降低。烤烟降茄二酮含量高于白肋烟和晒烟，可能由于烤烟烘烤调制过程中高温使茄酮的氧化降解反应加剧，降茄二酮生成量较多。

在烟草和香料化学研究的领域中， LC-GC检测法的优势显著，其烟叶样品前处理采用溶剂萃取，可避免传统水蒸馏提取方法造成的物质水解、氧化等，可更真实反映香气物质含量；HPLC作为净化手段，去除基质干扰的效果远优于固相萃取等常规手段。该方法使用的HPLC-GC在线联用的技术灵敏度、重复性、可靠性和效率较高，还可避免人为污染和氧化等不利因素[35]。本试验中茄酮含量低于以往测得值，是因为文献报道的香气物质测定多采用采用蒸馏法，茄酮与水形成的结合态遇水导致键的断裂，转化为游离态，使得测量值升高，本试验使用有机溶剂萃取游离态茄酮，更接近真实含量。烤烟的酮类香气物质总量和大多成分一般于35个月左右出现下降情况，白肋烟于60个月左右有下降趋势，晒烟则出现在50个月左右，证明烤烟主要酮类香气成分含量下降时间较白肋烟和晒烟更早。

4 结论

采用LC-GC检测法检测出的主要酮类挥发性香气物质有氧化紫罗兰酮、巨豆三烯酮、茄酮等。白肋烟烟叶样品中巨豆三烯酮、茄酮含量最高，烤烟烟叶样品中降茄二酮等含量最高，晒烟烟叶样品中β-紫罗兰酮等含量最高。6年自然贮藏过程中，巨豆三烯酮等物质含量先升高后降低，且白肋烟和晒烟升高时间持续较长，烤烟下降较早。3种类型烟叶西柏烷类降解酮类含量逐渐降低。综合分析，白肋烟和晾晒烟比烤烟更耐贮藏，应适当减少烤烟自然贮藏时间，宜控制在35个月左右，白肋烟和晒烟的贮藏时间应分别控制在60和50个月内更有利于提高烟叶的可用性。