肝细胞癌患者IL-18基因-137G/C和-607A/C位点单核苷酸多态性变化及其意义探讨*

刘 晶，段 炜，张进生，杨海宁，孙 鹃，惠增骞

IL-18编码基因位于第11号染色体（11q22.2-22.3）上，受上游具有启动作用的基因位点的调控，IL-18两个位点（-607A/C、-137G/C）的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）能够调节IL-18基因的表达，从而影响疾病的进程[1-4]。当前，有关这两个位点对IL-18基因表达的影响研究还主要集中在慢性乙型肝炎患者，而在HCC患者的研究报道结果不一[5]。本研究检测了肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者外周血IL-18-607A/C和-137G/C两个位点基因多态性，以探讨其与HCC发生的关系，为预防和治疗提供遗传学理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2015年6月～2017年6月本院诊治的HCC患者178例，男性92例，女性86例，年龄46～65岁，平均年龄（55.3±3.2）岁。依据原发性肝癌诊疗规范（2017年版）[6]，血清HBsAg阳性超过6个月，经临床表现、血清甲胎蛋白（alphafetoprotein，AFP）≥400μg/L、影像学和肝组织病理学检查诊断。排除标准：①合并其他恶性肿瘤者；②顽固性腹水、食管胃底静脉曲张破裂出血或有肝性脑病史者；③合并肺、肾、心等功能严重障碍者；④对药物过敏者；⑤精神疾病者。同时选择健康人251例，男性130例，女性121例；年龄47～65岁，平均年龄（56.1±2.8）岁。两组人群性别比例和年龄构成具有可比性（P＞0.05）。患者签署知情同意书。

1.2 标本采集与检测 抽取外周静脉血2 ml，加入EDTA抗凝管中，混匀，使用人全血DNA提取试剂盒（上海生物工程有限公司）提取DNA，置于-80℃备用。采用聚合酶链反应-连接酶检测反应（polymerase chain reaction-ligase detection reaction，PCR-LDR）法行IL-18基因分型。IL-18-137G／C SNP位点的上游引物序列为5’-AATAAAGTGGCA GAGGATAC-3’，下游引物序列为 5’-ACAGAGCCC CAACTTTTACG-3’；IL-18-607A／CSNP 位点的上游引物序列为 5’-TGCTGTATCAGATGCAAGC-3’，下游引物序列为5’-CTCTCCCCAAGCTTACTTT C-3’。PCR反应体系为20 μl，其中基因组DNA l μl，缓冲液 2 μl，MgCl 0.6 μl，dNTP 2 μl，Taq酶 0.2 μl，ddH20 12.2 μl，上、下游引物各 2 μl。PCR反应条件：95℃预变性2 min；94℃变性30 s，56℃退火 90 s，65℃延伸 30 s，40 个循环；最后65℃延伸10 min。使用3730型DNA测序仪（美国ABI公司）检测LDR荧光产物，应用Gene Mapper软件分析结果。

1.3 统计学处理 应用SPSS 20.0软件进行统计分析。采用t检验和x2检验比较年龄和性别等基线资料。采用拟和优度x2检验分析两组SNP位点实际检测的基因型频率分布是否符合哈-温（Hardy-Weinberg，HWE）平衡，P＞0.05被认为各基因型的分布符合HWE平衡。采用x2检验分析两组基因型和等位基因频率分布差异，以P＜0.05为差异具有统计学意义。采用非条件Logistic回归分析OR值和95%可信区间（CI），以衡量基因型和等位基因与HCC发生的风险。

2 结果

2.1 两组 IL-18-137G/C和-607A/C位点基因型和等位基因分布频率比较 HCC患者IL-18-137G/C位点的GG基因型和G等位基因频率显著高于健康人（P＜0.05，表1）；HCC 患者 IL-18-607A/C 位点的AA基因型和A等位基因频率显著高于健康人（P＜0.05，表2），说明HCC患者GG基因型、G等位基因、AA基因型和A等位基因分布更多。

2.2 两组IL-18-137G/C和-607A/C位点基因频率比较 HCC组IL-18-137G/C位点的GG基因和G等位基因频率显著高于健康人（P＜0.05，表3）；HCC组IL-18-607A/C位点的AA基因和A等位基因频率显著高于健康人（P＜0.05，表4），提示携带IL-18-137G/C和IL-18-607A/C位点基因型和等位基因者罹患HCC的风险增加。

表1 两组IL-18-137G/C位点基因型和等位基因分布频率（%）比较

表2 两组IL-18-607A/C位点基因型和等位基因分布频率（%）比较

表3 两组IL-18-137G/C位点基因频率（%）比较

表4 两组IL-18-607A/C位点基因频率（%）比较

3 讨论

IL-18属于亲炎症因子，具有多功能性，能够诱导IFN-γ的产生，所以也被叫做IFN-γ诱生因子，能够促进NK细胞和Th1细胞作用，提高免疫反应能力，促进分IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等炎症因子分泌，还能够聚集中性粒细胞[6-8]。人类第11号染色体11q22.2-q22.3就是IL-18的基因编码，其中研究最多的两个SNP位点就是启动子-137/-607[9]。研究显示该基因活性受到-137G/C和-607C/A的影响，-607C→A的结果将阻断cAMP与CREB结合，进而抑制CRE基因的转录[10-12]。-137由G变为C会阻断H4 TF21核因子结合，进而阻断其基因转录[13]。所以，IL-18与自身免疫性疾病等多种疾病有很大的关系。通过大量的数据分析发现，膀胱癌、肾细胞癌、胃癌和乳腺癌组织IL-18基因这两个位点C基因突变增加[14]。

本研究结果显示，HCC患者IL-18-37 G/C基因GG基因型和GC基因型分布频率以及G等位基因和C等位基因分布频率与健康人存在显著差异（P＜0.05），HCC患者IL-18-607A/C位点AA基因型和A等位基因分布频率显著高于健康人（P＞0.05），提示携带IL-18-137G/C和IL-18-607A／C位点基因型和A等位基因者罹患HCC的风险增加。对IL-18-607A/C位点基因分型发现，慢性乙型肝炎患者携带IL-18 A等位基因者显著高于慢性乙型肝炎康复者[15]，慢性乙型肝炎患者携带IL-18 A等位基因者也显著高于健康人[16]，说明IL-18 A等位基因是感染HBV的危险基因，不利于机体清除HBV感染而导致感染慢性化，并可能有机会发展至HCC。

本研究结果还显示，IL-18基因-137G/C和-607A/C位点基因型与HCC发生的关系，HCC患者IL-18位点GG基因型分布频率显著高于健康人（P＜0.05），G等位基因分布频率显著高于健康人（P＜0.05），HCC 患者 IL-18基因 -607A/C 位点 AA基因型分布频率显著高于健康人，（P＜0.05），A等位基因分布频率也显著高于健康人（P＜0.05）。同样地，有学者在巴西人群进行IL-18-607A/C及-137G/C两个位点的研究发现，原发性肝癌患者IL-18-607A/C位点AA基因型和A等位基因分布频率显著高于健康人，但是在两组之间IL-18-137G/C位点基因多态性无统计学差异，提示仅IL-18-607A/C位点AA基因型和A等位基因是原发性肝癌的易感基因，而IL-18-137G/C位点不属于易感基因[17、18]。另有研究显示IL-18-607A/C位点基因多态性与肝癌发生无关[19]，甚至有发现携带IL-18 GC基因型和C等位基因者肝癌发生率低，只有-607A/C位点CC基因型分布在PLC患者比较高，而并未发现其他的基因型或等位基因[20]。或许只有当携带IL-18-137G/C位点易感基因和慢性HBV感染同时存在时，才可能容易发展至肝癌，而关联基因型可能并不一致，具体原因还有待进一步研究。学者们怀疑可能是只有当IL-18基因在G→C突变的时候，突变过程导致基因转录活性降低，才可能抑制细胞转化过程。

综上所述，通过本研究，我们推测慢性HBV感染者发生IL-18-137G/C位点GG基因型和G等位基因，或-607A/C位点AA基因型和A等位基因突变时，转录基因活性降低，导致血清IL-18分泌减少，使机体免疫力和抗肿瘤能力降低，从而导致感染慢性化和增加肝癌发生的可能[21-23]。