糖尿病肾病大鼠血清miR-146a表达及其与炎症指标和氧化应激指标的相关性

高艳飞

(辽河油田总医院检验科，辽宁盘锦 124010)

糖尿病肾病(DKD)是糖尿病患者常见并发症之一。我国DKD的发病率呈不断上升之势，研究显示20%～45%的糖尿病患者存在不同程度的肾脏损伤，如不及早干预将进展为终末期肾病[1-2]。有关DKD具体发病机制和病理基础尚未完全阐明，越来越多的证据表明炎性反应和肾脏氧化应激损伤是引起DKD发病的重要环节[3-4]。有关miRNA在DKD发病过程中发挥的作用逐渐引起众多学者的重视。近年来研究发现miR-146a的表达在合并周围神经病变、糖尿视网膜病变等并发症的糖尿病患者中发生改变[5-6]。本研究主要分析DKD模型大鼠血清miR-146a的表达，及其与大鼠炎性反应和氧化应激指标的相关性。

1 材料与方法

1.1实验动物 SD雌雄大鼠100只，体质量203～215 g，购自中国科学院斯莱克实验动物中心(SCXK京2011-0012)，购回后适应性饲养2周后再用于实验。按照随机数字表法分为对照组(n=50)和模型组(n=50)。

1.2仪器与试剂 链脲佐菌素(Sigma公司，美国)；TRIzol总RNA提取试剂盒(Invitrogen，美国)；反转录试剂盒(ABI Applied Biosystems，美国)；RT-PCR试剂盒(TaKaRa，日本)；核转录因子-κB (NF-κB)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β和高级氧化蛋白产物(AOPPs)的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(美国R&D Systems公司)；超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)检测试剂(上海铭博生物科技有限公司)；TBA-40FR全自动生化分析仪(日本东芝公司)；尿清蛋白放射免疫测定试剂盒(中国原子能科学院同位素研究所)。

1.3DKD大鼠模型构建 对照组和模型组分别给予基础饲料和高糖高脂饲料(基础饲料64%、猪油8%、蛋黄粉9%、蔗糖18%、胆酸钠1%)喂养。8周后，模型组大鼠采用无菌枸橼酸钠缓冲液配制的链脲佐菌素(40 mg/kg)行腹腔注射，对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水，分别予以之前的饲料继续喂养4周。4周后，采集大鼠尾静脉血，TBA-40FR全自动生化分析仪检测空腹血糖(FPG)；代谢笼留取24 h尿液，采用放射免疫法测定尿清蛋白水平(μg/mL)，计算24 h尿蛋白排泄率(UAER，μg/min)=尿清蛋白水平×24 h尿液总量(mL)/60 min×24 h。若空腹血糖(FBG)≥16.7 mmol/L，UAER>30 mg/24 h，则视为造模成功。

1.4RT-PCR检测血清miR-146a表达 采集2组大鼠尾静脉血，TRIzol法提取血清总RNA，按反转录试剂盒操作说明反转录合成cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增，引物miR-146a上游：5′-GGG TGA GAA CTG AAT TCC A-3′，下游：5′-CAG TGC GTG TCG TGG AGT-3′。U6上游：5′-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T-3′，下游：5′-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3′。扩增条件：95 ℃,10 min；95 ℃,15 s；60 ℃,15 s；72 ℃,15 s；55 ℃,15 s；共计40个循环。采用2-ΔΔCt计算目的基因相对表达(RQ)，RQ=2-ΔΔCt。

1.5炎性反应和氧化应激指标检测 采集2组大鼠尾静脉血，采用ELISA法测定NF-κB、TNF-α、IL-1β、AOPPs水平。采用硫代巴比妥酸法和化学比色法测定MDA和SOD水平。

2 结 果

2.1血清miR-146a表达比较 对照组和模型组大鼠血清miR-146a表达量分别为23.14±5.81、14.67±4.59，模型组大鼠血清miR-146a表达量明显低于对照组，差异有统计学意义(t=5.720，P<0.05)。

2.22组血清NF-κB、TNF-α和IL-1β水平比较 模型组大鼠血清NF-κB、TNF-α 和IL-1β水平均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.32组血清SOD、MDA和AOPPs水平比较 模型组大鼠血清MDA和AOPPs水平明显高于对照组，SOD水平明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 2组血清NF-κB、TNF-α 和IL-1β水平比较

表2 2组血清SOD、MDA和AOPPs水平比较

2.4miR-146a与各指标的相关分析 模型组大鼠血清miR-146a与NF-κB、TNF-α、IL-1β、MDA和AOPPs呈显著负相关(P<0.05)，与SOD呈显著正相关(P<0.05)。见表3。

表3 miR-146a表达与各指标的相关分析

3 讨 论

miR-146a定位于人类基因染色体的5q34位点上，是一个典型的多靶基因调节器。已有研究显示miR-146a在糖尿病周围神经病变和糖尿视网膜病变等糖尿病并发症患者中的表达下降[5-6]。那么miR-146a在DKD发生、发展中扮演何种角色？miR-146a与慢性炎性反应和肾脏氧化应激损伤之间又存在何种联系？目前仍鲜有文献报道。本研究结果显示，模型组大鼠血清miR-146a表达明显低于对照组，这说明miR-146a可能在DKD的发生、发展中起重要作用。

NF-κB信号通路是重要的炎性反应通路，在免疫应答、炎性反应、细胞增殖和凋亡等多种过程中发挥调控作用。TAGANOV等[7]学者研究发现，在TNF-α 和IL- 1β等刺激下，通过NF-κB 通路上调miR-146a表达；而miR-146a反过来通过TNF受体相关因子6(TRAF6)和IL-1受体相关激酶1(IRAK1)，减少下游IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α等炎症因子的表达，从而形成一个负反馈调控过程。此外，HE等[8]学者证实，miR-146a是Notch的直接靶基因，可通过Notch信号通路途径调控其下游各种炎症因子的表达。本研究结果发现，模型组大鼠血清NF-κB、TNF-α和IL-1β的水平均明显高于对照组，相关性分析显示模型组大鼠血清miR-146a表达与NF-κB和TNF-α呈负相关。这也进一步证实了miR-146a可通过调节NF-κB及其下游炎症因子的表达参与DKD的发生、发展。

氧化应激损伤在DKD的发生、发展中起关键作用。高糖诱导细胞内活性氧(ROS)产生增加，导致ROS生成和清除失衡[9-10]。一方面，ROS增加会导致肾小球滤过膜上的负电荷丢失，破坏肾小球滤过屏障，带负电荷的清蛋白易于从肾小球滤过膜溢出。长期蛋白尿会导致肾小球和肾小管损伤。另一方面，ROS引起的氧化应激反应，致使脂质过氧化产物蓄积，引起肾脏损伤。SOD、MDA和AOPPs是评价机体氧化应激状态的常用指标，其水平反映了机体氧化应激损伤的严重程度。血清miR-146a表达变化与机体氧化应激损伤之间存在何种联系？尹斌等[11]学者研究显示，miR-146a可减轻过氧化氢所致人胃腺癌细胞株的氧化应激损伤，过表达miR-146a可明显增加细胞SOD活力，减少MDA水平。本研究结果显示，模型组大鼠血清MDA和AOPPs水平明显高于对照组，SOD水平明显低于对照组，说明模型组大鼠存在明显的氧化应激反应，肾脏氧化应激损伤可能是导致DKD发生、发展的重要原因。

综上所述，DKD大鼠血清miR-146a表达降低，可能参与了炎性反应和肾脏氧化应激损伤，从而参与DKD的发生、发展。miR-146a有望成为DKD的潜在分子标志物之一，从而指导疾病的诊断和治疗。