副干酪乳杆菌FM-LP-4菌株的高密度培养条件优化

王 英， 周剑忠， 施亚萍， 夏秀东， 董 月， 黄自苏

(1.江苏省农业科学研究院农产品加工研究所，江苏南京 210014； 2.南京市脆而爽蔬菜食品有限公司，江苏南京 211225)

细胞高密度培养(high-cell density cultivation，简称HCDC)技术是直投式发酵剂产业发展中的一个关键技术。营养物质、生长因子、代谢产物、培养时间、培养温度、溶氧等环境因素都可能影响细胞的高密度培养。目前国内外对菌体的高密度培养有大量的研究，主要集中在培养基筛选、配方优化和培养条件优化等方面[1-7]。

副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)是一种兼性厌氧、不运动、无芽孢的杆菌或长杆菌。研究表明，副干酪乳杆菌作为益生菌在增强人体免疫功能、调节人体肠道菌群平衡、预防疾病等方面有着广阔的发展前景[8-10]。副干酪乳杆菌FM-LP-4来源于新疆骆驼酸奶，它具有较高的体内、体外抗氧化活性[11]，且具有较强的适应环境能力和较好的加工属性，这些特性使其具有良好的应用前景。若要实现副干酪乳杆菌的工业化应用，须将该菌株制备成直投式发酵剂，而直投式发酵剂制备的关键是保证并提高菌种的活力和活菌数。根据副干酪乳杆菌FM-LP-4的生长需求，本研究从增殖培养基筛选和发酵条件2个方面进行研究，确定优化培养基配方和适宜的培养条件，为副干酪乳杆菌FM-LP-4直投式发酵剂的制备和产品开发提供试验依据，为其工业化应用提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 菌株资源

副干酪乳杆菌FM-LP-4保存于江苏省农业科学院农产品加工研究所。

1.2 培养基

MRS(de Man,Rogosa and Sharpe)液体培养基：2.000%葡萄糖、1.000%蛋白胨、1.000%牛肉膏、0.500% 酵母粉、0.500%乙酸钠、0.200%磷酸氢二钾、0.200%柠檬酸氢二铵、0.058%硫酸镁、0.020%硫酸镁、0.100%吐温-80。

UMRS(Unnormal de Man,Rogosa and Sharpe)液体培养基：MRS液体培养基中不添加碳源和氮源，配方为0.500%乙酸钠、0.200%磷酸氢二钾、0.200%柠檬酸氢二铵、0.058%硫酸镁、0.020%硫酸镁、0.100% 吐温-80，以上培养基在温度为121 ℃条件下、灭菌20 min。

1.3 主要设备及其来源

1.3.1 主要试剂与设备 主要试剂有1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，简称DPPH)，购自南京天为生物科技有限公司；吡咯烷二硫代氨基甲酸铵、邻菲罗啉，购自中国医药集团上海化学试剂公司；对氨基苯磺酸、盐酸奈乙二胺、亚硝酸钠及其他所用化学试剂均为分析纯级化学试剂，购自南京卓越生物工程有限公司。

主要设备有UV-1600PC紫外分光光度计，购自上海美普达仪器有限公司；YQX-11厌氧培养箱，购自上海跃进医疗器械有限公司；SW-CJ-1C型双人单面净化工作台，购自苏州净化设备有限公司；SIGMA3K-15台式冷冻离心机，购自北京五洲东方科技发展有限公司；124S-CW分析天平，购自赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；TOMY SX500自动灭菌锅，购自日本Tomy Digital Biology公司。

1.4 试验方法

1.4.1 培养条件优化 温度对FM-LP-4菌株生长的影响。挑取FM-LP-4菌株单菌落接种于MRS液体试管中，在温度为 37 ℃ 条件下培养20 h，然后2%接种量转接于新鲜的MRS液体培养基中，分别于温度为15、20、25、30、35、40 ℃下培养20 h，测定菌液的D600 nm，每组3个平行试验。

pH值对FM-LP-4菌株生长的影响。以1 mol/LHCL和NaOH调解MRS液体培养基pH值分别为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，按2%接种量接种FM-LP-4菌株的新鲜菌液，于温度为37 ℃下培养20 h，测定菌液的D600 nm，每组3个平行试验。

装液量对FM-LP-4生长的影响。50 mL三角瓶中培养基装液量分别为10、20、30、40、50 mL，按2%接种量接种FM-LP-4菌株的新鲜菌液，于温度为37 ℃条件下培养 20 h，测定菌液的D600 nm，每组3个平行试验。

接种量对FM-LP-4菌株生长的影响。接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%，接种于MRS液体培养基中，于37 ℃条件下培养20 h，测定菌液的D600 nm，每组3个平行试验。

培养条件正交优化。考虑到几种增殖因素之间可能存在联合协同作用，选定在单因素试验中以培养温度、接种量、初始pH值为重要的培养环境因素，利用L9(34)正交试验优化FM-LP-4菌株的培养条件。

表1 单因素试验的因素水平

1.4.2 培养基配方优化 碳源对FM-LP-4菌株生长的影响。在UMRS液体培养基上，分别以葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖、甘露糖为碳源，添加量为2%；氮源按照MRS培养基中的配方添加。按照2%接种量接种于液体培养基中，在34 ℃条件下培养20 h，每组3个平行试验，测定发酵液体的D600 nm。

碳源含量对FM-LP-4菌株生长的影响。在研究碳源影响的基础上，对所选碳源的浓度进行单因素试验，按照浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%配制MRS培养基，其他成分不变。按照2%接种量接种于液体培养基中，在34 ℃条件下静止培养20 h，每组3个平行试验，测定发酵液体的D600 nm。

氮源对FM-LP-4菌株生长的影响。在UMRS液体培养基上，选择蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏、酪蛋白胨、鱼蛋白胨、硫酸铵、硝酸钠作为氮源，添加量为2%，碳源按照MRS培养基中的配方添加。按2%接种量接于UMRS液体培养基中，在34 ℃条件下静止培养20 h，每组3个平行试验，测定发酵液体的D600 nm。

氮源含量对FM-LP-4菌株生长的影响。在研究氮源影响的基础上，对所选氮源的浓度进行单因素试验，按照浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%配制MRS培养基，其他成分不变。按照2%接种量接种于液体培养基中，在34 ℃条件下静止培养20 h，每组3个平行试验，测定发酵液体的D600 nm。

不同营养因子对FM-LP-4菌株生长的影响。选择包菜汁、番茄汁、胡萝卜汁、青辣椒汁、白菜汁、黄瓜汁作为营养因子，以不添加任何生长因子的MRS为空白对照，质量分数均为5%。按照2%接种量接种于液体培养基中，在34 ℃条件下静止培养20 h，每组3个平行试验，测定发酵液体的D600 nm。以MRS液体培养基作为对照组。

培养基正交优化。考虑到几种增殖因素之间可能存在联合协同的交互作用，选定在单因素试验中增殖效果较明显的几种增殖因素(葡萄糖、胰蛋白胨、番茄汁)进行L9(34)正交试验，其他成分按照MRS培养基中的含量进行配比。优化FM-LP-4菌株的增殖培养基。

表2 因素水平

1.5 验证试验

按照正交试验结果配制优化的培养基，进行接种FM-LP-4菌株培养，测定D600 nm，重复3次。

1.6 数据统计分析

采用SPSS 13.0软件进行统计分析；数据间差异比较采用t检验，差异显著水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 温度对FM-LP-4菌株生长的影响

由图1可以看出，随着温度的升高，FM-LP-4菌株的菌体密度呈先升高后降低的趋势，在温度为34 ℃时，菌体密度最高，因此，FM-LP-4菌株的适宜生长温度在34 ℃左右。

2.2 初始pH值对FM-LP-4菌株生长的影响

培养基的初始pH值对菌体的生长也有重要的影响，合适的pH值能缩短菌体的延滞期，较快地进入菌株对数生长期。由图2可知，MRS的初始pH值为6.5时，在相同的生长时间，菌体密度最高。因此，最适的初始pH值为6.5。

2.3 接种量对FM-LP-4菌株生长的影响

接种量较低会延长菌体的延滞期，接种量较高菌体会较快进入对数生长期，进而较快进入菌体稳定期，在稳定期菌体容易发生自溶现象，进而降低菌体密度。因此，合适的接种量也是菌体高密度培养的一个重要条件。由图3可以看出，随着接种量的增加，菌体密度呈现先增加后缓慢降低的趋势，接种量为4%时菌体密度达到最大值，但接种量为3%～5%时，菌体密度没有显著(P>0.05)区别，因此选择4%为最适接种量。

2.4 装液量对FM-LP-4菌株生长的影响

一般乳酸菌均是兼性厌氧型，环境的氧含量对菌株的生长有明显的影响。本研究利用50 mL三角瓶，装不同含量的MRS液体培养基，在相同条件下培养相同时间，检测FM-LP-4菌株的菌体密度。由图4可以看出，随着装液量的增加，FM-LP-4菌株密度升高，在装液量为40 mL条件下，菌体密度达到最高，但与装液量为50 mL的三角瓶中的菌体密度没有显著差异(P>0.05)，为操作方便，选择80%为最适装液量。

2.5 FM-LP-4菌株培养条件正交优化

考虑到因素之间可能存在联合协同的交互作用，选定在单因素试验中培养温度、接种量、初始pH值为3个主要因素，利用L9(34)正交试验优化FM-LP-4菌株的培养条件。由表3可以看出，3个因素对FM-LP-4菌株活菌增殖量的影响顺序为A>C>B，即影响FM-LP-4菌株生长发育的最主要环境因素是培养温度，其次是初始pH值。确定最佳增殖培养条件为A2B1C3，即培养温度为34 ℃、接种量为3%、初始pH值为6.8。

2.6 不同碳源对FM-LP-4菌株生长的影响

培养基中碳源和氮源成分及其适宜添加量的选择一直是改善乳酸菌生长的手段[12-13]，经常使用增菌培养基包括配制培养基(如MRS、M17等)、乳基质培养基、乳清基质培养基等，其中，乳基质培养基、乳清基质培养基比较适合乳酸菌的生长，生长达到稳定期的乳酸菌的菌体密度较高，但因其增殖慢或不易分离菌体而不宜采用。乳酸菌增殖培养基应具有以下2个特点：(1)适合菌体生长、繁殖速度快，在较短时间内可以得到大量高活力细胞；(2)菌体与培养基易分离、成本低廉[14-15]。因此，研究选择以MRS为基本培养基，在此基础上改变碳源、氮源，进而筛选合适的碳源和氮源。另外有研究报道，在MRS培养基中添加蔬菜汁能够改善乳酸菌的生长，增加菌体密度，因此，本研究选择一些常见蔬菜汁进行试验，目的是能够增加FM-LP-4菌株的菌体密度，为FM-LP-4菌株直投发酵剂的开发提供理论依据和技术支持。

表3 FM-LP-4菌株培养基条件优化正交试验结果

本研究选择乳酸杆菌属生长比较容易利用的葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖、甘露糖为碳源，这些碳源在市场上容易买到。由图5可知，不同碳源对FM-LP-4菌株生长的影响差别很大，其中以葡萄糖为碳源的培养基中 FM-LP-4 菌株的菌体密度最高，生长20 h时，D600 nm值达到2.14，其次是果糖，D600 nm值为2.09，以甘露糖为碳源的培养基中 FM-LP-4 菌株菌体密度最低，D600 nm仅为1.70，比以葡萄糖为碳源的培养基菌体D600 nm值低0.44，因此，选择葡萄糖为 FM-LP-4 菌株适宜生长碳源。

2.7 葡萄糖不同含量对FM-LP-4菌株生长的影响

添加合适量的碳源对菌体生长有很大的影响，较低的碳源含量不足以支持菌体的生长，高含量的碳源会增加培养液的渗透压，不利于菌体的生长。由图6可知，随着碳源含量的增加，菌体密度开始呈现增长趋势，当葡萄糖含量为3%时，菌体密度达到最高，但与4%葡萄糖含量的菌体密度差异不显著(P>0.05)，随着碳源含量的继续增加，菌体密度又呈下降趋势，因此，葡萄糖最适的添加量为3%。

2.8 不同氮源对FM-LP-4菌株生长的影响

选择蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏、鱼蛋白胨、硫酸铵、硝酸钠等氮源作为筛选适合FM-LP-4生长的氮源。由图7可知，有机氮源更适合FM-LP-4菌株的生长，在有机氮源中，以胰蛋白胨的促生长效果最明显，牛肉膏次之。因为牛肉膏中含有肌酸、肌酸酐、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类的水溶性物质，能够为乳酸菌生长提供多种营养物质，因此，对于氮源来说，选择胰蛋白胨和牛肉膏为复合氮源，其中，添加牛肉膏的含量按照MRS基本培养基的添加量进行，因为其除了作为氮源来源，还提供其他的营养成分。

2.9 胰蛋白胨不同含量对FM-LP-4菌株菌体密度的影响

添加合适量的氮源对菌体生长有很大的影响，较低的氮源含量不足以支持菌体的生长，高含量的氮源会增加培养液的渗透压，不利于菌体的生长。由图8可知，随着胰蛋白胨含量的增加，菌体密度先呈上升趋势，当胰蛋白胨含量为3%时，菌体密度达到最高，随着胰蛋白胨含量的进一步增加，菌体密度呈下降趋势，因此，胰蛋白胨最适的添加量为3%。

2.10 不同蔬菜汁对FM-LP-4菌株生长的影响

在乳酸菌高密度培养基的筛选和优化研究中，除了对氮源和碳源进行优化研究外，蔬菜汁对乳酸菌增殖的影响也有大量研究，葛宗昌等研究发现，马铃薯汁能促进干酪乳杆菌的生长[16]。本研究选择包菜汁、番茄汁、胡萝卜汁、青辣椒汁、白菜汁、黄瓜汁作为营养因子，检测不同的蔬菜汁对FM-LP-4菌株生长的影响。由图9可知，在MRS基础培养基中，添加不同的蔬菜汁，菌体密度呈不同的变化，其中，番茄汁对FM-LP-4菌株的增殖效果最好，MRS基本培养基中FM-LP-4菌株的D600 nm为1.992，含有番茄汁的FM-LP-4菌株的D600 nm高达2.213；其次是胡萝卜汁，D600 nm高达2.194，可见不同的菌株对蔬菜汁的响应是不同的，因此，选择番茄汁为最适的营养增殖因子。

2.11 番茄汁不同添加量对FM-LP-4菌株生长的影响

由图10可知，随着番茄汁添加量的增加，菌体密度开始逐渐增加，但增加到一定程度，增加效果不再明显，考虑到经济成本，选择合适的添加量为6%。

2.12 FM-LP-4菌株增殖培养基正交优化

几种增殖因素之间可能存在联合协同作用，选定在单因素试验中增殖效果较明显的几种增殖因素(葡萄糖、胰蛋白胨和番茄汁)进行L9(34)正交试验，其他营养成分按照MRS配方进行配制，以优化FM-LP-4菌株的最佳增殖培养基。由表4可知，3个因素对FM-LP-4菌株活菌增殖量的影响顺序为B>C>A，即影响FM-LP-4菌株生长发育的最主要因素是胰蛋白胨，其次是番茄汁。确定最佳增殖培养基配方为A2B3C2，即30 g/L的葡萄糖、35 g/L的胰蛋白胨、60 g/L番茄汁。

表4 FM-LP-4菌株培养基成分优化正交试验结果

2.13 验证试验

按照确定的培养基配方配制培养基，以原始MRS培养基为对照，装液量均为80%，以3%的接种量接种，在温度为 34 ℃ 条件下培养24 h，重复3次。原始培养基的FM-LP-4的D600 nm平均值为2.15，优化培养中FM-LP-4的D600 nm平均值为2.54，优化后的菌体D600 nm提高18.14%。

3 结论

通过对FM-LP-4菌株的培养条件和培养基进行研究，为FM-LP-4菌株作为功能型高密度发酵剂的制备提供技术支持。结果表明，FM-LP-4菌株培养条件的优化结果确定FM-LP-4菌株的最佳增殖培养条件是培养温度为 34 ℃、接种量为3%、初始pH值为6.8。FM-LP-4菌株培养基配方的优化确定为30 g/L葡萄糖、35 g/L胰蛋白胨、60 g/L 番茄汁，其他成分与MRS培养基基本配方一致。在优化后的培养条件下培养18 h，FM-LP-4菌体D600 nm提高18.14%。