金龙胆草SRAP遗传多样性及主要成分相关性分析

刘 姗， 何伟明， 陈 宇

(1.攀枝花学院生物与化学工程学院，四川攀枝花 617000； 2.干热河谷特色生物资源研发四川省高校重点实验室，四川攀枝花 617000)

金龙胆草(ConyzabliniiH. Lév)是一种菊科白酒草属2年生草本植物，为川滇的民间药材，被2015年版《中华人民共和国药典》[1]收录，该植物目前主要分布在四川攀(攀枝花市)西(凉山州自治区)地区，呈野生状态。该植物含有丰富的萜类、生物碱、皂苷、黄酮和挥发油等次生代谢物[2-4]，已有成药商品“金龙胆草浸膏片”用于治疗慢性支气管炎，其中黄酮类和皂苷为该植物的主要药用成分，其总皂苷具有较强的抗肿瘤活性而在近年来得到持续研究[5]。化合物苦蒿素是一种新克罗烷型二萜内酯，为药典中规定的该药材质量标准控制物。金龙胆草在一些文献中常被误记载为1年生草本，但经笔者所在实验室实际栽种后发现实为2年生植物，可见该药材的研究仍须要大力加强。本研究对攀西地区金龙胆草进行遗传多样性分析，并对其3种主要成分进行含量测定和分析，探究金龙胆草有效成分的相关性，为金龙胆草开展栽培药材的长期研究开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试用野生金龙胆草样品于同时期采集自四川省攀枝花市和凉山州，按照均衡抽样的原则，两两居群之间的地理距离>30 km，居群内样品间距离>15 m，每个居群采集>20株的样品，分布点见表1，由四川农业大学陈惠教授鉴定为金龙胆草。所有试验于2017年1—7月在干热河谷特色生物资源研发四川省高校重点实验室进行。

表1 16个金龙胆草采样点地理位置

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及PCR程序 按照DNA提取试剂盒(Omega Bio-Tek)进行DNA提取，并以λDNA/HindⅢ为maker，以质量浓度为10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测DNA分子量，并按照DNA(μg/mL)=50×D260 nm×稀释倍数测定样品浓度。引物序列如表2所示，按照预先筛选的12对引物进行扩增。RCR反应程序和产物的银染检测程序均按照文献[6]进行。

1.2.2 色谱条件 色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相，V乙腈∶V甲醇∶V水=15 ∶40 ∶45，等梯度洗脱；流速1.0 mL/min；检测波长210 nm；柱温30 ℃；进样量20 μL。

1.2.3 样品及对照品溶液的制备 为了更好地研究金龙胆草总皂苷、总黄酮和苦蒿素含量的相关性，笔者采用其所在课题组前期对该药材各成分优化后的提取工艺分别对3种成分进行提取，其中总黄酮含量采用超声波辅助提取，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法测定含量，以芸香苷为标准品，回归曲线为y1=10.946x1-0.007 1，r12=0.999 7，式中x1表示芸香苷含量，y1表示吸光度[7]；总皂苷采用纤维素酶法辅助微波提取，醋酸-香草醛-高氯酸显色测定含量，以齐墩果酸为标准品， 回归曲线为y2=0.234 3x2-0.122 7，r22=0.999 7，式中x2表示齐墩果酸浓度，y2表示吸光度[8]；苦蒿素采用索氏提取，高效液相色谱法测定精确含量，以苦蒿素为标准品，回归方程为y3=44.380x3+140.89，r32=0.999 3，式中y3表示吸收峰面积，x3表示苦蒿素含量[9]。

表2 SRAP引物序列

1.2.4 样品及对照品溶液的制备 利用Alpha Innotech Chemilmage5500 CCD成像仪将电泳图谱照片转换成 .tif格式，再用Quantity One软件将100～1 000 bp范围内清晰可见的条带进行标记，经过Match比对，有条带记为1，无条带记为0，形成一个“0、1”矩阵，计算每2个样品间的Nei’s遗传相似性系数S，S=2Njfb/Nj+Nf(Njf是二者共同的带数，Nj、Nf分别为二者特有的带数)。遗传距离为(1-S)。采用Popgen32软件进行基因多样性指数(H)、Shannon信息指数(I)、等位基因平均数(Na)及每位点有效等位基因数(Ne)分析，并计算多态位点数、多态位点比例；用NTSYSpc 2.1软件计算金龙胆草的Jaccard遗传相似系数(GS)，并按照不加权成对群算数平均法(UPGMA)进行聚类分析。利用SPSS 20.0进行样品间有效成分含量相关性的分析。

2 结果与分析

2.1 金龙胆草SRAP遗传多样性分析

12对引物的PCR扩增结果显示，每对引物扩增得到7～25条扩增带(图1)，分子量在200～1 000 bp。共得到318条清晰且重复性好的条带，其中275条为多态性条带，多态位点率为86.48%， 遗传多样性结果分析见表3，说明金龙胆草资源存在着一定的遗传差异，这为其育种研究提供了较好的选择基础。

表3 SRAP遗传多样性分析

分析结果显示，各来源地样品之间的相似性系数值在 0.496～0.880，平均相似系数为0.680，系统聚类树矩阵和距离矩阵的相关度可信度较高(Mat检测相关系数r=0.748)，遗传距离(1-S)的极值间差距不大(0.384)，这与SRAP多态性分析结果相符。系统聚类(图2)在相似系数0.699 0处将样品聚为三大类：1～9号为第Ⅰ类，该类含攀枝花市区域样品(除6样)和与该区域地理位置相近的凉山州样品(8、9号)。凉山州的样品聚为2类，第Ⅱ类为10～11号，第Ⅲ类为12～16号。聚类分析中同一群类中间杂有部分不同地理来源的样品，例如6号样品从地理位置的角度更应聚在第Ⅰ类，可见野生金龙胆草样品的分支并未严格按照地理来源划分，遗传多样性虽然与地理位置有很大关系，但植物的亲缘关系具有一定的复杂性，部分样品在自然分化时地理区域的影响小于遗传漂移，不能简单地依据地理位置划分。

2.2 有效成分含量测定

表4显示，以芸香苷为标准品测得的总黄酮含量普遍较高，平均含量达到6.31%；而以齐墩果酸为标准品测得的总皂苷含量居群间差异不大，平均含量为0.77%，与早前文献报道结果符合；高效液相色谱法测得的苦蒿素含量较早前文献[10]相比含量普遍较高，平均值为0.80%， 均远超出2015版《中华人民共和国药典》中对金龙胆草药材所作出的质量要求(>0.3%)。本次3种主要成分含量的试验测试结果比之前文献资料中的含量都高，可能是因为本试验立足产地，使用的均是新鲜植物材料，避免了长途运输、存放时长等不利因素带来的差异。

表4 金龙胆草3种主要成分含量测定结果(n=3)

2.3 有效成分的相关性和聚类分析

攀西地区野生金龙胆草有效成分含量相关性分析基于16个来源地样品中的总黄酮、总皂苷和苦蒿素这3种有效成分含量，结果(表5)显示所测有效成分含量间相互存在正相关关系(r>0)，其中只有总黄酮和苦蒿素的含量存在较显著相关性(P<0.05)。由图3可以看出，当聚类欧氏距离<15时，不同来源样品被分为4类，其中有效成分含量较为接近的6、7、9、10、15、16号聚为Ⅰ类，但该类海拔和地理位置均有差异；3号独自聚为Ⅱ类，2号和8号聚为Ⅲ类，这2类的所在地均具有较高的海拔(>2 000 m)，且所测成分含量都不高；1、4、5、11～14聚为Ⅳ类，其特征为采样点海拔均<2 000 m。

表5 金龙胆草有效成分相关性分析

由于攀西地区土地面积并不大，气候差异较多地体现在海拔不同，样品间差异不太明显，使得聚类结果和地理分布没有太大相关性。以主要成分含量为考查指标可以看出，7号样品(攀枝花市机场路样品)具有高出各样品平均水平的有效成分，其与处于最低水平的14号样品(凉山州西昌市)来自几乎同样的海拔高度，这说明海拔不是金龙胆草药材优劣的主要影响因素，气候和土壤环境等生态因子更值得考量，这一结果可指导后续遗传育种研究时可用7号样品所在地为研究对象进行深入的生态因子研究，摸索出最佳的金龙胆草栽培生境。

3 讨论

分光光度法和高效液相色谱法都是植物次生代谢物含量研究的常用方法[11-13]，分光光度法有较大的背景干扰，对测定单一成分存在误差，高效液相色谱法能较准确分析单组分含量，但无法全面反映一类物质的总量。因此，本研究分别采用分光光度法测定金龙胆草总黄酮和总皂苷的含量，采用高效液相色谱法测定苦蒿素成分的含量。分光光度法测量总黄酮时，显色反应发生在邻二酚羟基、3-羟基-4-酮基、5-羟基-4酮基部位，不发生在-羰基、5-羟基部位[14-15]，因此具备此母核的黄酮类成分均能被检测到。金龙胆草总黄酮类成分主要为此结构，含有少量的槲皮素和山奈酚，不具备上述结构，可能无法计入总量[15]，但由于这2种成分在金龙胆草中含量极少，对结果影响不大，因此使用芸香苷为标准品可满足金龙胆草总黄酮的检测需求。金龙胆草皂苷以齐墩果烷型三萜皂苷为主，因此使用齐墩果酸为标准品，采取经典醋酸-香草醛-高氯酸显色法进行检测也具备准确性和代表性。

4 结论

本研究对攀西地区野生金龙胆草的16个主要居群进行SRAP遗传多样性分析，并检测了样品间总黄酮、总皂苷和苦蒿素含量。结果显示，金龙胆草在攀西地区遗传多样性并不丰富，这可能与该植物还是以野生为主、区域间流动较小有关。对金龙胆草主产区不同来源样品的有效成分相关性分析结果显示，成分含量均为正相关，但除苦蒿素和总黄酮外，其余成分间相关性不显著(P>0.05)。以成分含量进行的聚类分析结果和分子标记结果相比较，显示成分的含量高低与遗传关系聚类有一定相关性，如2种分析下11～14号样都聚为一类，但有效成分的积累可能与生态因子更为相关，这也符合其他学者提出的中药材道地性与其生物学基础相关性的假说[16-18]。要深入研究本药用植物，还须在今后的研究中对金龙胆草生境的影响因子如温度、湿度、光照、土壤成分等进行详细测量，与本试验数据相结合，以便获得全方位的植物生长信息参数。