江苏省迟熟中粳新品系稻瘟病抗病基因检测与抗性评价

朱勇良， 范方军， 谢裕林， 伍应保， 乔中英， 张建栋

(1.江苏太湖地区农业科学研究所，江苏苏州 215155； 2.江苏省农业科学院粮食作物研究所，江苏南京 210014)

江苏省太湖稻区以种植单季晚粳稻居多，近年来为了主动对接农业供给侧改革，对品种成熟期性状的研究已拓展到迟熟中粳稻的选育和应用方面，并且取得了较好的成效，如苏香粳3号的审定和在适种地区作为特优早熟品种的产业化配套应用。由稻瘟病病菌(Magnaportheoryzae)引起的稻瘟病是水稻的三大病害之一，对水稻持续高产稳产和品质有重要的影响。稻瘟病在苗期和抽穗期均可发生，在抽穗期发病可导致白穗或半饱和穗，大大降低水稻产量，严重时可导致绝收。

水稻稻瘟病的抗性受多基因或数量性状位点(quantitative trait locus，简称QTL)控制，随着分子生物学的发展和水稻基因组测序的完成，定位并克隆了一批抗稻瘟病基因。Pi-b基因是第1个通过图位克隆得到的稻瘟病抗性基因，该基因位于水稻第2号染色体长臂末端[1-3]。Bryan等将水稻稻瘟病基因Pi-ta定位于水稻第12号染色体靠近着丝点附近的区域，并进行了克隆[4]。稻瘟病抗病基因Pi54，最初被命名为Pi-kh，来源于水稻品种Tetep，与简单重复序列(simple sequence repeats，简称SSR)标记TRS26和TRS33紧密连锁[5]。Xu等将稻瘟病基因Pi-kh精细定位在水稻第11号染色体上单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，简称SNP)标记Kh45F～KhA3R之间的270 kb区间内，PiQ-kh仅包含1个外显子，编码1个由330个氨基酸组成的含核苷酸结合位点-亮氨酸重复序列(nucleotide binding site-leucine rich repeat，简称NBS-LRR)结构的抗病蛋白[6]。

本研究选择Pi-ta、Pi-b、Pi-kh/Pi54等抗病基因的功能标记，检测2016年迟熟中粳稻预备试验95份试验材料，结合苗瘟和穗颈瘟人工接种鉴定，对抗病基因进行抗病性评价。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料为2016年江苏省迟熟中粳稻预备试验新品系，由江苏省农业科学院迟熟中粳稻预备试验鉴定点提供，共95份。

1.2 DNA提取

采用十二烷基苯磺酸钠法提取水稻基因组DNA。以基因组DNA为模板，按下列反应体系进行PCR反应。反应体系(20 μL)含2.0 μL模板DNA(约15 ng/L)、2.0 μL引物(4 pmol/L)、2.0 μL 10×Buffer(25 mmol/L)、1.2 μL MgCl2(25 mmol/L)、0.4 μL dNTP(2.5 mmol/L)、0.2 μLTaqDNA聚合酶(5 U/μL)、12.2 μL灭菌双蒸水。在Biometra PCR仪上进行扩增，反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共35个循环；72 ℃再延伸10 min。反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，用溴化乙锭染色，在紫外凝胶成像仪上观察并照相。

1.3 稻瘟病抗性鉴定方法

稻瘟病抗性鉴定的供试菌株为江苏省农业科学院植物保护研究所2015年分离得到的江苏省稻瘟病病菌代表菌株，分别为ZB7、ZC11、ZD5、ZE3、ZF1、ZG1，并由植物保护研究所进行接种鉴定。水稻苗瘟抗性鉴定采用苗期喷雾法进行接种，每个处理3次重复。苗瘟抗性分为6级，0级为免疫，1级为高抗，2级为抗病，3级为中抗，4级为感病，5级为高感。

水稻穗颈瘟的抗性鉴定采用上述稻瘟病病菌菌株孢子的混合液在水稻孕穗初期进行注射接种。在水稻成熟后进行水稻穗颈瘟的抗性调查。穗颈瘟抗性分为6级，0级为无病，1级为抗病，3级为中抗，5级为中感，7级为感，9级为高感。

1.4 稻瘟病基因功能标记的检测

根据等位基因特异PCR原理，针对Pi-ta、Pi-b、Pi-kh/Pi54抗感等位基因序列差异设计引物(表1)，利用这些功能标记检测试验材料。利用Pi-ta引物检测到1 042 bp片段，同时NPi-ta引物扩增不出目的片段，这样的材料含有Pi-ta基因[7]；利用Pi-b引物检测到365 bp片段，同时NPi-b引物扩增不出目的片段，这样的材料含有Pi-b基因，而Pi-b基因不能扩增出目的片段，但NPi-b引物扩增出 803 bp 片段的材料携带有感病基因[2]；抗病基因Pi-kh功能标记为共显性标记，扩增片段大小为216 bp(抗)/359 bp(感)[8]。

表1 用于PCR反应的引物名称、序列及预期片段长度

2 结果与分析

2.1 抗稻瘟病基因功能标记检测

利用抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b、Pi-kh标记检测95份试验材料，由表2可知，检测到携带Pi-ta抗病基因的材料有59份(部分结果见图1)，携带Pi-b抗病基因的材料有74份，携带Pi-kh抗病基因的材料有85份。检测到仅携带Pi-ta、Pi-b、Pi-kh基因的材料分别有1、3、3份，同时携带Pi-ta、Pi-b基因的材料有5份，同时携带Pi-ta、Pi-kh基因的材料有16份(1份Pi-ta检测为杂合)，同时携带Pi-b、Pi-kh基因的材料有29份，3个基因都携带的材料有37份，3个基因都不携带的材料有1份。

表2 供试材料抗病基因的分布及与苗瘟抗性等级的相关性

注：“no”表示不含抗病基因。表4同。

2.2 水稻苗瘟的抗性鉴定

由表2可知，苗瘟等级为0级的材料有3份，苗瘟等级为1级的材料有44份，苗瘟等级为2级的材料有30份，苗瘟等级为3级的材料有13份，苗瘟等级为4级的材料有4份，苗瘟等级为5级的材料有1份。携带抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pi-kh的水稻品种，其苗瘟抗性等级绝大部分都在中抗及以上，但同时携带抗病基因Pi-ta、Pi-kh的水稻品种，苗瘟抗性更高，大部分品种都达到高抗及以上水平，但也有1个品种同时携带抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pi-kh，苗瘟抗性等级为高感。

2.3 水稻穗颈瘟的抗性鉴定

由表3可知，在水稻孕穗初期人工接种鉴定穗颈瘟抗性等级为0、1级的材料均有0份，为3级的材料有7份，为5级的材料有51份，为7级的材料有35份，为9级的材料有2份。

表3 95份材料苗瘟、穗颈瘟人工鉴定与分子标记检测结果

注：“+”表示携带抗病基因；“-”表示携带感病基因。

2.4 抗稻瘟病基因与穗颈瘟抗性的关系

由表4可知，携带Pi-ta抗病基因的材料有59份，携带Pi-b基因的材料有74份，携带Pi-kh基因的材料有85份。不携带这3个抗病基因的材料有1份，它的稻瘟病抗病等级为7级。只携带其中1个抗病基因的材料有7份，其中稻瘟病抗病等级为5级的材料有3份，为7级的材料有4份；携带2个基因的材料有50份，其中稻瘟病抗病等级为3级的材料有4份，为5级的材料有25份，为7级的材料有19份，为9级的材料有2份；携带3个抗病基因的材料有37份，其中稻瘟病抗病等级为3级的材料有3份，为5级的材料有23份，为7级的材料有11份，为9级的材料有0份。该结果表明，只携带1个抗病基因或不携带抗病基因的材料其抗性都为5级或以上，且大部分都在7级或以上，携带2个或3个抗病基因的材料其抗性等级可达到3级，且大部分材料的抗性等级为5级。同时携带稻瘟病抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pi-kh的材料有37份，其中3份穗颈瘟为中抗，其余为感病，表明聚合这3个基因的材料穗颈瘟表现既有抗病也有感病，说明这些材料的抗性不是由这3个基因互作产生的，须要进一步挖掘这些材料的抗病基因，并应用于穗颈瘟的抗病育种研究中。

表4 供试材料抗病基因的分布及与穗颈瘟抗性等级的相关性

3 结论与讨论

传统的水稻抗病育种一般通过杂交、回交、复交等方法，这种育种方法既耗时又耗力。分子标记辅助选择是结合生物技术的一种新型育种方法，主要利用与目的基因紧密连锁或基因本身的分子标记选择基因型，不受水稻生育期和环境的影响，但一般是连锁标记，有时达不到选择效果。

水稻抗病育种一直是育种家的重点研究内容之一，特别是稻瘟病的抗病育种[9-11]。随着一大批水稻稻瘟病基因的定位与克隆，开发了一批稻瘟病基因功能标记。本研究利用Pi-b、Pi-ta、Pi-kh功能标记对2016年迟熟中粳稻预备试验95份材料进行抗病基因检测，携带Pi-b、Pi-ta、Pi-kh抗病基因的品种，其苗瘟抗性等级基本达到中抗水平，同时携带Pi-ta、Pi-kh抗病基因的大部分品种抗性穗颈瘟达到5级，表现为中感。分别携带Pi-b和Pi-ta、Pi-b和Pi-kh的品种，穗颈瘟表现为中感、感病或高感。同时携带Pi-b、Pi-ta、Pi-kh抗病基因的品种有1份苗瘟抗性等级为5级，其穗颈瘟抗性等级达到7级，另外还有6份材料苗瘟为1级(高抗)，但穗颈瘟达到7级，苗瘟和穗颈瘟抗性表现不一致，表明苗瘟和穗颈瘟抗性控制可能不一致。携带有3个抗病基因的材料有37份，稻瘟病抗性综合指数﹥5.00的材料有12份，达不到江苏品种审定标准，这与范方军等的研究结果[12]不一致，表明随着江苏省稻瘟病生理小种的进化，稻瘟病抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pi-kh的抗性正在丧失，亟须进一步挖掘利用其他抗病基因。