复合氨基酸-铁、锌、铜配合物的合成及其抗肿瘤抗菌生物活性研究

吴 菁

南昌市第一医院药剂科，江西南昌 330008

复合氨基酸是人体生命运动中所必须的基本物质，具有增强人体免疫功能、加强营养吸收的作用，能够缓解身体和精神的疲劳，能够改善肝肾功能以及增加记忆力等。有关研究报道，化合物与金属元素，特别是人体必需微量元素，发生配合反应时，其活性会显著增加[1-7]。铁、锌、铜都是人体必需的微量元素，对人体的生理功能具有促进作用。本研究将复合氨基酸和铁、锌、铜三种人体必需微量元素进行配位化学反应，并研究其抗肿瘤抗菌作用，以期获得活性更强的药物，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

复合氨基酸（苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、胱氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、天门冬氨酸、苏氨酸、色氨酸、丝氨酸、羟脯氨酸、精氨酸、脯氨酸）（购于深圳市万和制药有限公司，生产批号H20000478，纯度>99%，相对分子质量为 126）；Fe2（SO4）3（分析纯）；ZnSO4·7H2O（分析纯）；CuSO4·5H2O（分析纯）；氢氧化钠（分析纯）；96 孔培养板（美国Costar公司）；健康昆明小鼠[体重（22±2）g，重庆医科大学实验动物中心购买，证号SCXK（渝）2007-0001]；超净工作台（苏州净化设备厂）；85-1恒温磁力搅拌器（常州国华电器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 复合氨基酸铁、锌、铜配合物的合成 称取30 g复合氨基酸，加入纯水，搅拌并过滤去掉不溶解的成分，平行制备3份溶液。分别称取硫酸铁、硫酸锌、硫酸铜与氢氧化钠反应，得氢氧化铁、氢氧化锌、氢氧化铜沉淀，分别将3种沉淀加入配置好的复合氨基酸溶液中，分别按复合氨基酸:金属离子（摩尔比）=2:1进行反应，设定温度在60℃左右，再进行水浴加热，逐渐加热至80℃，不断滴加氢氧化钠溶液，反应6～12 h，过滤，除去未反应不溶物质，得深蓝色滤液，加丙酮溶液立即沉淀，60℃烘干，得蓝色固体产物。

1.2.2 复方氨基酸、复合氨基酸铁、锌、铜配合物小鼠急性毒性实验 将复合氨基酸铁、锌、铜配合物、复方氨基酸溶于纯水，配置为60%的溶液，按文献要求的最大耐受剂量法[8]对每只小鼠进行灌胃给药，给药量为5 g/kg，并观察两周，记录小鼠的生存情况。

1.2.3 复合氨基酸铁、锌、铜配合物的体外抗肿瘤实验方法 将肿瘤细胞（A549、HepG2），用含胚牛血清（浓度为10%）的RPMI-1640培养基配置成细胞浓度为1×104个/ml。将上述细胞接种在96孔板中，每个孔加入的量为 100 μl，放置在温度 37℃、5%CO2培养箱中进行培养，培养的时间为24 h。吸出并更换培养基后，加入 5 个浓度（20、40、80、160、320 μmol/L）的复合氨基酸、复合氨基酸铁、锌、铜配合物，每孔 100 μl，每个浓度设5个复孔，空白组只加培养基。之后继续放置在培养箱中培养，培养时间为48 h，再在每个孔中加入MTT培养，培养时间为4 h，培养后弃上清液，再加入DMSO，振荡，将96孔板放置在在酶标仪中，于570 nm处测定吸光度。计算公式，抑制率=（1-实验组A值）/对照组A值×l00%，计算结果。

1.2.4 复合氨基酸铁、锌、铜配合物抗菌实验 采用微生物划线法将沙门菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌培养后，细菌配置的浓度为2×105个/ml，在96孔板中使用倍比稀释法稀释为 5个浓度（2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 mg/ml）的复合氨基酸铁、锌、铜配合物，上述每个浓度再设置5个复孔，再在每个孔中加入相等量浓度的菌液，细菌在37℃的培养箱中培养，培养时间为24 h，通过观察96孔板是否为透明，对应几种药物溶液浓度最小的透明的孔，该孔即为该药物的最小抑菌浓度MIC。

2 结果

2.1 复合氨基酸-铁、复合氨基酸-锌、复合氨基酸-铜配合物的产率

反应产物经烘干恒重后，称量产物重量，计算产率，结果见表1。

表1 复合氨基酸-铁、复合氨基酸-锌、复合氨基酸-铜配合物的产率

2.2 三种金属配合物中铁、锌、铜的配位比及金属含量

为确定复合氨基酸铁、锌、铜三种金属配合物的化学结构，即复合氨基酸与铁、锌、铜三种金属的配位比，采用EDTA滴定法测定所得产物中铁、锌、铜的含量，结果见表2。

表2 三种金属配合物中铁、锌、铜的配位比及金属含量

2.3 急性毒性实验结果

复方氨基酸及复合氨基酸-铁、复合氨基酸-锌、复合氨基酸-铜配合物灌胃给药后，所有小白鼠的活动虽然会稍微减弱，但均能快速地恢复正常，无论是呼吸、食量还是其他各项活动均显示为正常，没有出现中毒的症状。连续给药2周，所有小鼠都没有死亡，并且未出现任何中毒的症状，提示复合氨基酸及铁、锌、铜等3种配合物对小鼠灌胃给药的急性毒性（LD50）＞5000 mg/kg。 根据 LD50剂量分级，三种金属配合物经口给药都属于实际无毒范围。

2.4 抗肿瘤作用结果

采用MTT法测定复合氨基酸及其三种金属配合物对 A549、HepG2 的 IC50，结果见表 3。

表3 复合氨基酸及复合氨基酸-铁、锌、铜配合物的IC50值（μmol/L）

2.5 抗菌作用结果

采用倍比稀释方法考察复合氨基酸及其三种金属配合物对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的抑制作用，结果见表4。

表4 复合氨基酸及复合氨基酸-铁、锌、铜配合物的MIC值（mg/ml）

3 讨论

复合氨基酸有些为人体所必须的氨基酸，而铁、锌、铜虽然也是人体必需微量元素，但服用过量也有一定毒性，文献报道，有机化合物与金属离子发生配合反应生成配合物后毒性会降低[9-10]，这与本研究急性毒性实验结果一致，复合氨基酸-铁配合物、复合氨基酸-锌配合物、复合氨基酸-铜配合物三种金属配合物对小鼠均无毒，原因有可能是无机金属离子过量本身是有毒性的，但是经过与有机物反应后，金属键转变为配位共价键，金属离子的毒性消失或降低。复合氨基酸与铁、锌、铜三种金属的配位比均为2:1，推测是氨基酸的氨基和羧基与金属离子发生了配位反应，因氨基和羧基均有孤对电子，可将电子提供给缺电子的正价金属离子。

另外，实验合成的3种复合氨基酸金属配合物，抗肿瘤抗菌作用均强于复合氨基酸，表明复合氨基酸与金属离子反应生成配合物后，其生物活性显著增强，因为很多氨基酸和金属离子本身具有抗菌抗肿瘤的作用，而将二者通过化学方法合成新的产物，可能发挥了氨基酸和金属离子的协同作用，因此生物活性增强，可见，复合氨基酸金属配合物显示出较大的药用开发价值，有必要进一步深入研究。