一种快速检测岷江百合总RNA样本中基因组DNA残留的方法

杜文凯 袁素霞 胡凤荣

（1. 南京林业大学风景园林学院，南京 210037；2. 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

百合（Liliumspp.）为我国栽培历史悠久的药、食、赏多用途植物，世界五大鲜切花之一。随着现代分子生物学的不断发展，百合花色［1］、花香［2］、发育［3］及抗性［4］等相关基因的研究都取得了较大进展，为今后百合分子育种奠定了良好基础［5］。

前人对百合基因功能研究中，基因表达分析占据了重要地位［6］。实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qRT-PCR）是一种快速检测基因表达量的方法，因其具有高通量、高灵敏和实时检测等特点，目前被广泛应用于植物基因表达水平研究中［7-8］。尽管qRT-PCR操作简单，但qRT-PCR的准确性却受多方面因素影响，如引物特异性、反应体系和RNA质量等［9-12］。RNA样本中基因组DNA残留对后期基因表达分析的准确性具有很大影响，残留的基因组DNA一方面会影响RNA浓度的精确定量；另一方面，残留的DNA也会影响qRT-PCR扩增效率［13］。目前，常采用设计跨内含子引物的方法来避免基因组DNA残留对供试基因表达结果的影响［14-16］。但是很多物种的基因组测序尚未开展，很难将所有待研究基因的引物都设计为跨内含子引物［17］。因此，为了保证qRT-PCR结果的准确性，获得高质量且无基因组DNA残留的总RNA样本是非常必要的。

目前，市面上RNA提取试剂盒和第一链cDNA合成试剂盒种类繁多。虽然大部分RNA提取试剂盒中都包含有DNA去除步骤，但DNA是否去除干净无法得知。此外，为了避免总RNA样本中有残留的基因组DNA污染，部分第一链cDNA合成试剂盒中也加入了基因组DNA去除步骤，但cDNA质量无法预知。因此，为了检测总RNA和cDNA样本中基因组DNA残留是否去除干净，本研究从前期得到的转录组数据（尚未发表）中筛选了1个高度保守的持家基因TIP41-like，拟针对其内含子序列设计引物，以期可简便快捷的检测百合总RNA以及cDNA样本中有无基因组DNA残留，为后续相关基因表达分析的准确性奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 供试材料为岷江百合（Lilium regale）组织培养植株，保存于中国农业科学院蔬菜花卉研究所组培室。随机选取6株生长发育一致的组培苗，分别取其叶片，经液氮速冻后，于-80℃冰箱保存备用。

1.1.2 试剂 选择3种不同公司生产的RNA提取试剂盒（分别标记为A、B、C，均含有基因组DNA去除步骤）用于提取岷江百合叶片RNA。采用2种不同公司品牌的第一链cDNA合成试剂盒（分别标记为Ⅰ、Ⅱ；Ⅰ不含有基因组DNA去除步骤，Ⅱ含有基因组DNA去除步骤）用于合成cDNA。

1.2 方法

1.2.1 含内含子的DNA序列扩增 从岷江百合转录组数据（尚未公布）中获得了持家基因TIP41-like的一段mRNA序列，利用DNAMAN 5.0软件将其序列与NCBI数据库中所有物种的TIP41-like基因组序列进行比对，推测该岷江百合TIP41-like部分序列对应的基因组DNA序列中含有2个内含子，并使用Primer Premier 5.0软件根据此段序列设计DNA扩增产物中含2个内含子的引物 ：F：5′-CCGAAAATCAGGGTAGGGTG-3′及 R ：5′-CGAAGCCAGAAACGGAGAAGA-3′。引物由上海生工生物公司合成。

以岷江百合叶片DNA为模板进行PCR扩增，PCR 反应体系20 μL ：模版DNA 2 μL，PCR Forward Primer 0.5 μL，PCR Reverse Primer 0.5 μL，2×Taq PCR Magic Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。

PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30秒，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环35次；72℃延伸5 min。反应结束后，取6 μL产物用2%琼脂糖凝胶电泳并观察拍照。

1.2.2 基因组DNA残留检测引物设计 将含内含子序列的DNA扩增产物送至上海生工生物公司测序，利用DNAMAN 5.0软件对所得到的序列进行核酸拼接；将拼接好的序列与TIP41-like转录组mRNA序列进行比对，寻找出内含子序列。根据所获得的TIP41-like内含子序列，利用Primer Premier 5.0软件设计基因组DNA残留检测引物，引物设计时应保证引物其中任意一端序列全部落在内含子序列上，引物设计完成后由上海生工生物公司合成。以岷江百合叶片DNA为模板进行PCR扩增，反应体系参照1.2.1。反应结束后，取6 μL产物用2%琼脂糖凝胶电泳并观察拍照。

1.2.3 RNA样本中基因组DNA残留检测 通过1.2%琼脂糖凝胶电泳对三种不同RNA提取试剂盒提取的岷江百合叶片的总RNA样本进行检测，利用Quawell Q3000超微量紫外分光光度计检测总RNA的质量和浓度。

以3种不同RNA试剂盒提取的岷江百合叶片总RNA为模板，使用基因组DNA残留检测引物进行PCR扩增，PCR反应体系20 μL：模版RNA 2 μL，PCR Forward Primer 0.5 μL，PCR Reverse Primer 0.5μL，2×Taq PCR Magic Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。

PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环35次；72℃延伸5 min。反应结束后，取6 μL产物用2%琼脂糖凝胶电泳，并观察拍照。

1.2.4 cDNA中基因组DNA残留检测 以两种不同公司品牌的第一链cDNA合成试剂盒对3种RNA提取试剂盒提取的18个RNA样本分别进行第一链cDNA合成。以获得的cDNA为模板，分别使用基因组DNA残留检测引物进行PCR扩增，反应体系参照1.3.3。反应结束后，取6 μL产物用2%琼脂糖凝胶电泳并观察拍照。

2 结果

2.1 含内含子的DNA序列扩增及序列比对

以DNA为模板，使用扩增产物中含内含子的引物（F/R）进行PCR扩增，获得了条带单一的目的片段（图1）。将此DNA扩增产物送上海生工生物公司测序，得到了片段大小为367 bp的碱基序列。利用DNAMAN 5.0软件将测序获得的DNA产物片段与转录组mRNA序列进行比对发现，此DNA扩增产物共有2段内含子序列（图2）。

图1 岷江百合TIP41-like含内含子DNA片段扩增结果

图2 TIP41-like含内含子DNA片段和对应的mRNA片段序列比对结果

2.2 基因组DNA残留检测引物设计

根据2.1比对结果，设计了一对基因组DNA残留检测引物 ：LDRG-F：5′-CTCTTTTATGACGAGGTTGGTA-3′及 LDRG-R ：5′-CAGGGAAATCGGTCAGTGTT-3′。其中LDRG-R引物全部落在内含子序列上（图 2）。

岷江百合叶片DNA为模板，对设计的基因组DNA残留检测引物（LDRG-F/LDRG-R）进行PCR扩增验证，获得了条带单一与预期产物长度（182 bp）结果相一致的扩增片段（图3）。

图3 岷江百合基因组DNA残留检测片段扩增结果

2.3 RNA样本检测

三种RNA提取试剂盒提取的总RNA经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果（图4）显示，28S和18S rRNA条带清晰，无杂带和弥散现象。经Quawell Q3000检测，OD260/280在1.8-2.1范围内，表明提取的RNA完整性好，无蛋白质污染。

使用基因组DNA残留检测引物（LDRGF/LDRG-R）对提取的总RNA进行检测，结果（图5）显示，使用试剂盒A和B提取的12个总RNA样本中均能扩增出条带，且条带清晰，表明总RNA样本中含有较高浓度的DNA残留。使用试剂盒C提取的总RNA样本中未能扩增出条带，表明此总RNA样本中无基因组DNA残留。

2.4 cDNA样本中基因组DNA残留检测

利用第一链cDNA合成试剂盒Ⅰ、Ⅱ对三种RNA提取试剂盒提取的总RNA样本分别进行反转录，使用基因组DNA残留检测引物（LDRGF/LDRG-R）对获得的cDNA样本进行检测，结果（图6）表明：两种cDNA合成试剂盒合成的cDNA 样本中A1-A6和B1-B6均能扩增出目的片段，C1-C6无法扩增出目的条带，表明两种cDNA合成试剂盒均无法去除RNA样本中残留的基因组DNA。

图4 三种不同RNA提取试剂盒提取的岷江百合叶片总RNA电泳检测结果

图5 总RNA样本中基因组DNA残留检测片段扩增结果

3 讨论

RNA质量是影响qRT-PCR准确性的关键因素之一［18-21］，本课题组在前期qRT-PCR实验中发现，待测基因的相对表达量不稳定，推测总RNA样本可能存在基因组DNA残留，因此，建立一种快速高效地检测总RNA样本中基因组DNA残留的方法具有重要的实践意义。本实验在前期得到的转录组数据中挖掘了一个持家基因TIP41-like，根据其部分内含子序列设计了一对基因组DNA残留检测引物，用于检测总RNA和cDNA样本中的基因组DNA残留。

图6 cDNA样本中基因组DNA残留检测片段扩增结果

基因组DNA残留是抑制后续实验中反转录和实时荧光定量PCR反应的重要因素［22-23］。目前RNA提取过程中去除基因组DNA最常用的方法就是加入DNase Ⅰ消化［24］。本研究采用了3种不同公司生产的RNA提取试剂盒对岷江百合组培苗叶片进行了总RNA提取，通过RNA凝胶电泳和纯度检测无法得知总RNA样本中基因组DNA是否去除干净（图4）。但使用基因组DNA残留检测引物（LDRG-F/LDRG-R）对总RNA样本进行扩增后发现，尽管3种试剂盒提取过程中均含有DNA去除步骤，但是RNA质量差异较大，总RNA提取试剂盒A、B提取的RNA样本均存在严重的基因组DNA污染，而试剂盒C提取的总RNA样本无基因组DNA残留（图5）。

此外，部分试剂公司为了避免总RNA样本中残留基因组DNA，第一链cDNA合成试剂盒中增加了基因组DNA去除步骤。在本试验中，尽管第一链cDNA合成试剂盒Ⅰ中含有基因组DNA去除步骤，但还是无法去除总RNA样本残留的基因组DNA（图 6）。

目前，很多研究都是将获得的总RNA和cDNA样本直接用于后续试验［25-26］，尽管市面上大多数RNA提取试剂盒和部分第一链cDNA合成试剂盒中都加入了基因组DNA去除步骤，但获得的总RNA和cDNA样本质量无法预知，因此，为了保证qRTPCR实验的准确性，必须对提取的总RNA及cDNA样本进行基因组DNA残留检测，这一点应该引起从事类似科学研究者的重视。本研究依据持家基因TIP41-like部分内含子序列设计的基因组DNA残留检测引物，可快速检测岷江百合总RNA以及cDNA样本中有无基因组DNA残留，以确保后续待测基因表达分析的准确性，并为其他百合材料以及其他物种相关研究提供参考。

4 结论

依据转录组中持家基因TIP41-like的部分内含子序列设计了1对基因组DNA残留检测引物：LDRG-F ：5′-CTCTTTTATGACGAGGTTGGTA-3′及LDRG-R ：5′-CAGGGAAATCGGTCAGTGTT-3′，能够快速检测总RNA样本中的基因组DNA残留。