OPA-FMOC柱前衍生化HPLC法测定两种常用食用菌中蛋白氨基酸和非蛋白氨基酸的含量

谢志茹，程敏，谭丽容，肖雪，李莎莎

（1.广东药科大学中药学院，广东广州 510006）（2.弘正道（中国）中药研究有限公司，广东广州 510623）

（3.广东省中医院，广东广州 510006）

食用菌具有极好的营养价值和保健功效，如抗菌、抗肿瘤、降血压、降血脂、护肝和健胃助消化等，这可能与其中的氨基酸（AA）和蛋白质成分有关[1,2]。基于此，已有关于其蛋白质及氨基酸的研究报道[3,4]。AA作为具有生物活性的植物次生代谢产物，其活性与AA的种类及含量有关，如螺旋藻水解肽的抗氧化性与其氨基酸含量有关[5]。另一项研究也证明食物蛋白水解物具有潜在的抗氧化活性且该活性与适当量的特定氨基酸相关[6]。

游离氨基酸（FAAs）是人体维生素E及叶酸的来源[7]，也是提高或改善天然食品鲜味和风味的重要成分[8,9]，如天冬氨酸及谷氨酸对紫果西番莲的鲜味起重要作用[10]。蛋白氨基酸（PAA）为常见的组成人体蛋白质的 20种氨基酸[11]，是蛋白质执行生命活动的基础物质。非蛋白氨基酸（NPAA）如 γ-氨基丁酸、鸟氨酸作为功能性氨基酸，具有充当神经递质、抗癌、抗菌等生物活性[12]，目前对游离氨基酸的研究多是对PAA的测定，如王富花利用HPLC法测定茶叶中17种蛋白氨基酸[13]，唐翎利用柱前衍生HPLC法测定猴头菌丝体中 15种游离蛋白氨基酸[14]。香菇、金针菇作为常用食用菌，于海龙等利用氨基酸测定仪测定香菇子实体中常见 18种 PAA[15]，陈惜燕等利用HPLC-ELSD对包含金针菇在内的8种食用菌的15种PAA进行测定[16]，均缺少对NPAA的测定。故本文以香菇及金针菇为例，测定常用食用菌中的 PAA及NPAA，并通过对比氨基酸组成及含量，对其营养价值及风味进行评价。

目前对氨基酸的测定有阳离子交换色谱法及高效液相色谱法，前者准确性高，但是灵敏度较低，且价格相对昂贵。后者因氨基酸属于极性大且无紫外吸收的一类化合物，故需进行衍生化，该方法方便快捷，故本文采用OPA-FMOC柱前衍生化HPLC法对香菇及金针菇中PAA及NPAA进行测定，以期为食用菌的进一步开发及利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 原料

1.1.1 原材料

香菇（批号：YY02AB2016、YY05AB2016、XG16B03-170705、KDX16D04-170726、XG16E06-170830、YG03AC2016、YG02AC2016）、金针菇（批号：WLJZG170901、WLJZG170902、WLJZG170703、WLJZG170801）干品均由弘正道（中国）中药研究有限公司提供。

1.1.2 试剂

乙腈、甲醇（HPLC级）购于德国默克公司；氢氧化钠、磷酸二氢钠、四氢呋喃、硼酸购于天津市致远化学试剂有限公司；3-巯基丙酸购于上海麦克林生化科技有限公司；邻苯二甲醛（OPA）、氯甲酸-9-芴基甲酯（FMOC）购于美国Sigma公司；天冬氨酸（Asp，批号 wkq16082503）、谷氨酸（Glu，批号wkq17010904）、天冬酰胺（Asn，批号wkq17010305）、丝氨酸（Ser，批号wkq16090603）、甘氨酸（Gly，批号wkq16110106）、苏氨酸（Thr，批号wkq16090801）、精氨酸（Arg，批号wkq16090702）、丙氨酸（Ala，批号 wkq17011305）、 γ-氨 基 丁 酸 （GABA，wkq17011602）、酪氨酸（Tyr，批号 wkq16090304）、α-氨基丁酸（AABA，wkq17021001）、缬氨酸（Val，批号 wkq16082004）、甲硫氨酸（Met，批号wkq16090704）、苯丙氨酸（Phe，批号wkq16090605）、异亮氨酸（Ile，wkq16092108）、鸟氨酸（Orn，批号wkq17020103）、亮氨酸（Leu，批号 wkq16090402）、赖氨酸（Lys，批号wkq16090804）、脯氨酸（Pro，批号wkq16101204）购于四川省维克奇生物科技有限公司，纯度均≥98%；纯化水自制。

1.1.3 主要仪器设备

Agilent1260高效液相色谱仪（配有G1322A在线脱气机、G1311C四元泵、G1316A柱温箱、G1315D二极管阵列检测器、G1329B自动进样器）、Agilent ChemStation色谱工作站（版本 04.03.054.），美国Agilent公司；pH计、十万分之一天平、万分之一天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；Milli-Q超纯水仪系统，美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 供试品的制备

香菇子实体、金针菇全株干品粉碎，过60目筛，分别取2.0 g粉末加18倍水，浸泡1 h，回流提取4 h，补足失重，提取液过0.22 μm微孔滤过，得供试品。

1.2.2 氨基酸测定方法的建立

依据Xiao X所做研究并进行改进[17]。1.2.2.1 溶液配制

OPA溶液：取OPA 80 mg，加0.4 mol/L硼酸盐缓冲液（pH 10.4）7 mL，乙腈1 mL，3-巯基丙酸125 μL，溶解；FMOC溶液：取FMOC 40 mg，加乙腈8 mL溶解。

1.2.2.2 色谱条件

色谱柱：Alltima C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温：25 ℃；流动相A：25 mmol/L磷酸二氢钠-四氢呋喃（体积比为 995：5，pH=7.2）；流动相 B：50 mmol/L 磷酸二氢钠-甲醇-乙腈（体积比为 50：35：15，pH=7.2）。梯度洗脱程序为：0～8 min，5%～19% B；8～20 min，19%～35% B；20～34 min，35%～60% B；34～40 min，60%～70% B；40～50 min，70%～100% B；50～80 min，100%～100% B。流速：0.8 mL/min。检测波长：0～60 min，338 nm；60～80 min，262 nm。使用程序进样，将5 μL 样品、5 μL 硼酸盐缓冲液、1 μL OPA溶液、1 μL FMOC溶液、28 μL蒸馏水置于定量环中混合，进样20 μL。

1.2.2.3 标准曲线绘制及方法检出限测定

准确称取AA标准品适量，用1% HCl溶液制备成1 mg/mL溶液。再将其混合，制备混标，并进行梯度稀释。进样分析，绘制峰面积-质量浓度标准曲线，求回归方程和相关系数。并将信噪比为3时AA浓度作为检出限。

1.2.2.4 仪器精密度考察

取香菇样品，按 1.2.1项制备供试品，按1.2.2.2项下色谱条件进行检测，连续进样6针，记录保留时间及峰面积，并计算保留时间及峰面积的RSD。

1.2.2.5 方法重复性考察

取香菇样品，按1.2.1项平行制备供试品6份，按

1.2.2.2项下色谱条件进行检测，记录保留时间及峰面积，并计算保留时间及峰面积的RSD。

1.2.2.6 方法稳定性考察

取香菇样品，按1.2.1项制备供试品，于0、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h，按1.2.2.2项下色谱条件进行检测，记录保留时间及峰面积，并计算保留时间及峰面积的RSD。

1.2.2.7 加样回收率

取香菇样品，按100%含量加入AA标准品，按

1.2.1项平行制备供试品6份，按1.2.2.2项下色谱条件进行检测，记录峰面积，并计算加样回收率。

1.2.3 样品测定

取香菇、金针菇供试品，按照1.2.2.2项下色谱条件进行氨基酸的测定。

1.3 数据分析

利用Agilent ChemStation工作站，根据色谱图，对比色谱峰保留时间进行定性分析，根据峰面积和标准曲线对样品中AA进行定量分析。

味道强度值（taste active value，TAV）是某AA组分浓度与其味觉阈值的比值。

2 结果与讨论

2.1 香菇及金针菇中AA的组成

19种AA混标、香菇及金针菇中AA HPLC测定结果如图1所示，在该色谱条件下可以实现19种AA的分离，在金针菇和香菇中AA的种类仅相差1种，金针菇中无Met。在香菇中含有15种PAA，分别为Asp、Glu、Asn、Ser、Gly、Thr、Arg、Ala、Tyr、Val、Met、Phe、Ile、Leu、Lys，2种NPAA，分别为GABA、Orn。本研究改进Xiao X研究中的色谱条件流动相B组成，达到AABA同Tyr，GABA同Ala的分离度大于1.5，从而实现同时测定17种PAA和2种NPAA；一级氨基酸最大吸收波长为338 nm，二级氨基酸最大吸收波长为262 nm，故本研究中增添262 nm检测波长以检测Pro。

图1 19种AA混合标准品溶液（a）、金针菇（b）、香菇（c）HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of mixed AA standards sample(a),Flammulina velutipes(b) and Letinous edodes(c)

2.2 标准曲线绘制及方法检出限

以各AA质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到各AA的回归方程及相关系数，AA混标进行梯度稀释后测定检出限。结果见表1。由表 1可知在线性范围内，相关系数（r2）分布在0.9990～1.0000，说明AA峰面积与质量浓度的线性关系良好，此条件可用来测定AA含量。

表1 19种AA标准曲线Table 1 Regression equations and correlation coefficients for AA

2.3 仪器精密度

17种AA保留时间RSD分布在0.01%～0.26%之间，峰面积RSD分布在1.56%～4.77%间，表明仪器精密度良好。

2.4 方法重复性

17种AA保留时间RSD位于0.02%～0.34%之间，峰面积RSD位于1.72%～4.78%之间，表明该方法重复性较好。

2.5 方法稳定性

在 24 h内，17种 AA保留时间 RSD为0.02%～0.24%，峰面积RSD为1.41%～4.42%，表明样品在24 h内稳定性较好。

2.6 加样回收率

本试验的加样回收率为101.24%～105.59%之间，说明该方法准确度较高。

2.7 香菇及金针菇质量评价

2.7.1 香菇及金针菇PAA中EAA及FAA评价

香菇及金针菇中PAA含量测定结果如表3所示，两种菌类中PAA含量存在较大的差异。金针菇中PAA含量为16.79 mg/g，其中有6种EAA，分别为Thr、Val、Phe、Ile、Leu、Lys，含量为 5.98 mg/g，结果与已有研究略有差异[18]，可能与金针菇的来源、品种不同有关。香菇中PAA含量为10.99 mg/g，其中EAA为7种，含量为4.39 mg/g，同金针菇中EAA相比多了Met。两种常用食用菌中，金针菇的PAA、EAA含量较高，营养价值高；香菇的 EAA种类多，营养价值均衡。

TAV为呈味物质测定值与呈味物质味觉阈值的比值[19]。本研究参考的味道阈值为氨基酸的水溶液测定值[20]。由表 3可知，在香菇中大于味觉阈值的 FAA有Glu、Arg、Ala、Val、Met和Lys，其TAV值分别为8.4，1.5，2.8，1.4，4.3，1.3。在金针菇中FAA的TAV大于阈值的有Glu、Arg、Ala、Val、Phe和Lys，其TAV值分别为9.1，2.1，4.4，1.5，1.6，3.1。在香菇中，FAA总量为5.40 mg/g，Glu和Met为主要的FAA，其含量为3.83 mg/g，在金针菇中，FAA总量为9.96 mg/g，其主要FAA为Glu和Ala，含量为5.38 mg/g。Glu是鲜味氨基酸中的特征氨基酸，Ala为呈甘味的特征氨基酸[21]，Met可发生美拉德反应而形成肉香[22]。在两种常用食用菌中，金针菇的 FAA含量高于香菇，金针菇比香菇味道更鲜美。

2.7.2 香菇及金针菇中NPAA

NPAA是除组成人体蛋白质的常见 20种氨基酸之外的氨基酸，且其参与神经传递，具有抗癌、抗菌等生物活性[12]。两种菌类中NPAA有GABA和Orn，香菇中NPAA含量为2.37 mg/g。金针菇中NPAA含量为3.99 mg/g。

氨基丁酸分为 α-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、β-氨基丁酸三种类型，均具有抑菌作用[23]，其中GABA属于强神经抑制氨基酸，具有多种生物活性，如镇静、降血压、抗焦虑、抗抑郁、增强记忆力等[24～27]。在两种食用菌中均检测到GABA，且金针菇中GABA含量为2.38 mg/g，香菇中为 1.59 mg/g。作为新资源食品，SFDA允许GABA可作为食品添加剂，我国规定其摄入量不得超过500 mg/d。

鸟氨酸作为NPAA，同样具有广泛的生物活性，因其参与尿素循环，故对机体有一定的解毒作用，可刺激脑垂体分泌生长激素，促进糖、脂肪的代谢而促进蛋白质的合成[28]，同样也具有增强免疫力、抗癌的活性[29]。在金针菇中含量为1.61 mg/g，香菇中为0.78 mg/g。金针菇中NPAA含量高于香菇，结合其增强免疫力，提高记忆力等保健功能，金针菇营养价值高于香菇。

表2 精密度、稳定性、重复性、加样回收率（%）Table 2 Precision, stability, repeatability and recovery tests of AA (%)

表3 香菇、金针菇中AA含量及TAV值Table 3 Content of FAA and TAV value in Letinous edodes and Flammulina velutipes(±s, Letinous edodes: n=7; Flammulina velutipes:n=4)

表3 香菇、金针菇中AA含量及TAV值Table 3 Content of FAA and TAV value in Letinous edodes and Flammulina velutipes(±s, Letinous edodes: n=7; Flammulina velutipes:n=4)

AA 味道特征 味觉阈值/(mg/g) AA含量/(mg/g) TAV香菇 金针菇 香菇 金针菇Asp^ 鲜（+） 1.0 0.26±0.09 0.24±0.09 0.3 0.2 Glu^ 鲜（+） 0.3 2.53±0.75 2.73±0.39 8.4 9.1 Asn - - 0.41±0.11 0.34±0.07 - -Ser 甜（+） 1.5 0.44±0.07 0.86±0.18 0.3 0.6 Gly^ 甜（+） 1.3 0.30±0.10 0.79±0.17 0.2 0.6 Arg 甜/苦（+） 0.5 0.73±0.23 1.04±0.23 1.5 2.1

注：*为必需氨基酸；^为呈味氨基酸；Δ为非蛋白氨基酸；（+）为令人愉快的味道；（-）为令人不愉快的味道；-为未报道；ND为未检出。

3 结论

3.1 本研究采用OPA-FMOC柱前自动衍生化法对氨基酸样品进行测定，在该色谱条件下可实现19种氨基酸的分离，采用仪器自动衍生，操作方便，结果可信，可用于金针菇、香菇中PAA及NPAA测定。

3.2 香菇中EAA种类多于金针菇，金针菇中EAA、FAA、NPAA含量均高于香菇，基于游离氨基酸，金针菇营养价值高，味道鲜美，香菇营养价值更均衡。