基于HRM技术的大白菜InDel标记高效检测技术构建及其应用

张志刚，司立英，赵智中，王荣花，王立华，李巧云，刘栓桃

(1.山东省农业科学院蔬菜花卉研究所/国家蔬菜改良中心山东分中心/山东省设施蔬菜生物学重点实验室,山东 济南 250100; 2.聊城市东昌府区农业局,山东 聊城 252000)

插入/缺失 (Insertion/Deletion，简称InDel) 标记是基于全基因组重测序数据开发的针对基因组中核酸序列的插入或缺失而设计的PCR标记，是一种共显性标记，具有较好的稳定性和丰富的多态性[1-3]，适合全基因组已经测序物种的种质多样性分析、遗传图谱构建、QTL定位、基因型鉴定、杂交种真实性以及纯度鉴定等方面的研究。InDel标记的检测手段常根据插入/缺失序列的大小，而采用琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或荧光毛细管电泳[3-5]，鲜见采用高分辨率熔解曲线技术检测InDel标记的有关报道。

高分辨率熔解曲线(high-resolution melting，HRM)分析技术是近年来发展的一种用于突变扫描和基因分型的分子遗传学分析方法。其原理主要是根据DNA序列的长度、GC含量以及碱基互补性差异，致使任一双链DNA分子在加热变性时都有一个特定的熔解曲线性形状。Ririe等[6]较早报道利用荧光染料对双链 DNA 进行熔解曲线分析的研究，自2000年以来，利用荧光标记的探针大大提高了HRM检测的准确性和灵敏度，可以有效检测PCR产物间单个碱基的差异[7]。近年来，随着饱和荧光染料的开发和使用，HRM检测可以不使用成本较高的探针，而是在常规PCR反应体系中直接加入饱和荧光染料，PCR结束后在高分辨率曲线检测设备上实现闭管直接分析，从而大大简化试验流程、降低试验成本[8-10]。HRM技术已经在医学和动植物单核苷酸多态性(SNP)分型方面得到非常广泛的应用[10-14]，然而其在InDels标记检测方面的应用还比较少。赵均良等[15]应用HRM技术检测了一个水稻的SSR标记，该标记涉及四个碱基的差异，在非变性PAGE胶上难以区分，用HRM技术得到较好的分辨。苏晓梅[16]利用HRM技术开发了一个番茄抗Ty1-InDel标记，利用该标记对83份番茄材料进行精准鉴定，取得良好效果。刘源霞等[17]将基于重测序技术开发的10个抗苹果炭疽病InDel标记中的4个成功转化成HRM标记，并用于对分离群体的鉴定。关于大白菜InDel标记的HRM分析技术尚未见报道。本试验在前期研究基础上，对已经鉴定的593对InDel标记[3]进行筛选和验证，以获得利用HRM分析技术可以实现稳定检测的InDel标记，并利用这些标记对课题组创制的大白菜种质和大白菜杂交种进行鉴定，构建基于HRM技术的大白菜InDel标记的高通量检测技术，为实现大白菜种质和杂交种纯度的高效和高通量鉴定提供标记储备和技术保障，也为InDel标记的广泛应用提供新的途径和借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究选择前期已经完成全基因组重测序的大白菜自交系He102与06-247[3]作为基于HRM技术的InDel标记开发的标准内参材料。HRM高效检测技术的构建则随机选择本课题组自行创制的大白菜种质90份和牛早秋1号杂交种，种子直播后于幼苗期取叶片备用。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA提取 参照刘栓桃等[18]的方法，取大白菜幼嫩叶片组织约2 cm2置于2 mL螺口提取管中，加3粒直径4 mm的陶瓷珠，再加800 μL TPS (100 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L KCl，10 mmol/L EDTA，pH 8.0) 提取液，于自动研磨仪 (法国, Precellys24) 上5 000 r/min振荡10 s，65℃恒温箱保温30～60 min，冷却后4℃、12 000 r/min离心10 min；上清转移至新的离心管中，加入等体积氯仿颠倒混匀以去除杂蛋白，然后4℃、12 000 r/min 离心10 min；上清用等体积的异丙醇沉淀DNA，DNA沉淀用100 μL 10 mmol/L 的Tris-HCl (pH 8.0) 溶解后，用NanoDrop 2000分光光度计测定 DNA 浓度，并将工作液浓度稀释到10 ng/μL并于-20℃保存备用。

1.2.2 InDel标记筛选 参照张志刚等[3]的研究结果，从593对已经验证的InDel标记中选择，选择标准参照刘栓桃等[4]的方法，即引物的扩增结果在06-247与He102中特异性好、仅有单一目的条带、无杂带干扰。从BRAD[19]数据库中下载大白菜参考基因组序列(Brapa_sequence_v1.5), 根据引物所在位置以及重测序结果获得差异目标片段序列，用软件TMUtility_1.5预测序列的Tm值并计算每对引物扩增的差异片段的Tm差值，如果差值绝对值大于0.2℃则将该对引物确定为潜在的适宜HRM分型的InDel标记(潜在标记)，用于后续的梯度PCR验证。

1.2.3 用于HRM分析的PCR扩增体系 标记的验证在梯度PCR仪 (Eppendorf Mastercycler®nexus gradient) 上进行。PCR反应体系包含10 μL，有如下成分：2×Taq PCR Mastermix [天根生化科技(北京)有限公司产品，KT201-12]5 μL、10 pmol/L 正/反向引物各1 μL、LC Green 饱和荧光染料(Idaho, BCHM-ASY-0005) 1 μL、灭菌双蒸水2 μL，以25 μL石蜡油覆盖。循环参数为95℃预变性120 s；94℃ 30 s，60～68℃ (沿96孔板从A—H横向平均递增约1.28℃) 30 s，72℃ 10 s，42次循环；循环结束后25℃保存。PCR结束后在LightScanner-96(Idaho Technology Inc.)高分辨率熔解曲线分析仪上直接进行分析。采用小片段扩增法，用LightScanner Software Version 2.0 软件进行自动分型。

1.2.4 基于HRM技术的InDel标记的高通量检测体系及其应用 由于LightScanner-96一次最多只能检测96个样品，为了适应仪器的要求，降低检测成本、提高检测效率，在一块96孔PCR板上只检测一对引物，纯系对照分别以He102与06-247为模板，杂合型对照以He102与06-247的DNA等量混匀物为模板，对照重复两次以确保对照样品被成功扩增。本研究将A1、B1和A2、B2分别设置为He102与06-247两个标准对照品，将H11和H12两个孔设置为杂合型对照，其余90个孔是待检测样品。PCR反应体系同上，退火温度根据上述梯度PCR分析的结果确定，PCR结束后样品的分析同上。

2 结果与分析

2.1 InDel标记的初步筛选

从已经验证的593对InDel标记中，通过PAGE胶扩增条带的识别，共筛选出特异性好、在06-247与He102中仅能扩增出单一条带、变异位于编码区的标记271对。对于这些筛选到的标记，逐一预测目标片段的Tm值以及Tm差值，其中有63对标记，其包含差异位点片段的Tm差值绝对值大于0.2℃，这63对标记的变异信息在10条染色体上的分布见表1。

表1 预测InDel标记在大白菜基因组中的分布

2.2 适宜HRM分型的InDel标记

由于饱和荧光染料的加入会改变引物的退火性质，因此对每对中选引物先进行梯度PCR扩增，以确定最佳退火温度。引物IDA01058的梯度PCR扩增结果分型报告如图1所示。报告主体由四部分组成，如图1 A—D。其中图1A是分析参数的简要概括，有熔解曲线分析温度设置的起止范围(melt temperature range)、荧光信号捕获的曝光时间(exposure)、基因分型(amplicon genotyping analysis parameter)参数，主要包括选择的温度范围(temperature range )、灵敏度(sensitivity)的设置(默认是normal，即常规)、标准物质(standards)的选择(本试验以06-247与He102两种材料在65.2℃即E5和E6的扩增产物熔解曲线为两种标准基因型对照，即图中的Use Internal Standards)。

图1B表示本报告分析的样品在96孔PCR板上的直观排列，白色是剔除的样品，第5列 (以He102为模板)和第6列(以06-247为模板)是本报告分析的样品，E5(以He102为模板的扩增子熔解曲线指定为AA，系统以红色表示)和E6(以06-247为模板的扩增子熔解曲线指定为BB，系统以灰色表示)是设定的内标基因型，软件运行分型后，会自动按照给定的基因型标准给出分型结果，并按相应的颜色展示出来。如图1B所示，凡是与E5熔解曲线相同的基因型，以红色体现，而凡是与E6熔解曲线相同的基因型以灰色体现。与两者都不匹配的，显示未知并以绿色体现。

图1C和图1D分别是各样品的熔解曲线形式和对应的峰值转化图，线条颜色与图1B相对应。从分型结果可以看出，He102的扩增子在不同的退火温度下扩增效率有显著区别，虽然高于63.9℃的5个孔(D5—H5)的样品都成功分型为一类，但从熔解曲线的形式直观看，只有4个孔(E5—H5)的曲线高度拟合，其退火温度在65.2℃及以上。而以06-247为模板的扩增子其扩增效率受退火温度的影响较小，所有孔的样品熔解曲线均高度拟合。综合两者的扩增结果，引物IDA01058的最佳退火温度应在65.2～68.0℃之间。采用相同的方法分析其它62对引物，最终从中筛选到20对适合用高分辨率熔解曲线进行分析的引物，其退火温度基本是在最初设计的退火温度基础上加5℃。

A:分型报告运行参数；B：分型报告的样品在96孔板上的排列及其基因型鉴定结果；C：分析样品的熔解曲线图；D：分析样品的熔解曲线峰值转换图。下图同。

2.3 基于HRM技术的大白菜InDel标记高通量检测体系及应用

采用鉴定的InDel标记IDA01061的正反向引物，在96孔PCR板上对90份种质进行鉴定，鉴定结果的自动分型报告如图2所示。与图1的结构相同，图2A显示了自动分型的基本参数，图2B是分型结果在96孔板上的直观体现，从中可以看出，3个标准样品即纯合基因型AA(A1、B1)、BB(A2、B2)以及杂合基因型AB (H11、H12)的扩增结果重复性非常好，这表明反应体系和反应条件非常适宜。其余90份待检样品全部得到精准鉴定，结果直观展示在96孔板上。其中8份种质是纯合AA基因型，72份种质是纯合BB基因型，10份种质在该位点为杂合型。相应结果可以通过软件导出为Excel表格，从而实现自动分型。图2C和2D分别是均一化处理后的熔解曲线图和熔解曲线峰值转换图。

采用标记IDA10055对牛早秋1号的杂交种纯度进行鉴定，采用同样的96孔板布局，鉴定结果的熔解曲线如图3所示。在鉴定的90株幼苗中，杂合型AB有85株，杂合率94.4%，其余5株都是BB(母本)基因型，未检出AA(父本)基因型。

图2 基于HRM技术的InDel标记对大白菜种质的鉴定报告

AA、AB、BB指不同基因型。

图3基于HRM技术的InDel标记对牛早秋1号>杂交种纯度鉴定的熔解曲线

3 讨论与结论

高分辨率熔解曲线(high-resolution melting, HRM)分析技术是基于核酸小片段之间的GC含量差异而导致双链核酸解链温度差异的一门检测技术。该技术具有三大优势：一是操作简单、快捷、节省时间成本；二是高通量、高灵敏度、高特异性、低成本且不受检测位点的限制；三是闭管操作、无污染且DNA不受损伤，熔解分析后还可以进行凝胶电泳或测序分析[20]。HRM技术在大白菜突变体筛查方面的研究已有报道。刘梦洋等[21]采用HRM分析技术鉴定大白菜EMS诱变的突变体，筛选到单碱基突变材料，而有关利用HRM技术检测插入/缺失突变及其在大白菜种质筛查和杂交种纯度鉴定方面的应用尚未见报道。

本研究发现，HRM技术所需仪器LightScanner具有快速灵敏的特性，为保证熔解曲线平滑无杂峰，就要求PCR产物最好只有单一扩增产物。这一点我们在筛选标记时作了充分考虑，只选择那些前期鉴定为单一扩增条带的引物[3]，作为适宜HRM技术检测的备选标记。另外，为了提高转化的成功率，用特定的软件对目标扩增产物的熔解温度进行预测，从271对特异性好的标记中筛选到63对适宜进行HRM分析的标记，最终用PCR方法扩增标准材料，获得了20对适宜用HRM技术分析的InDel标记，转化成功率高达31.7%。梯度PCR的结果证实，加入饱和荧光染料后，引物的退火温度普遍比预测的退火温度升高5℃，这为后续应用HRM技术转化其它标记提供了借鉴。

在构建基于HRM技术的高通量InDel标记检测体系时，为了提高分析的准确率，同时简化分析流程、降低试验成本，本研究在每块96孔PCR板上都设置两种纯合基因型对照以及两种纯合基因型模板等量混合后的杂合基因型对照，每个对照重复两次，以确保对照样品被成功扩增而获得对照样品的熔解曲线作为内设标准基因型对照，这样便于用软件对供试材料进行自动分型。本研究将开发的基于HRM技术的InDel标记用于大白菜种质鉴定和杂交种纯度鉴定，取得良好分析效果。

无论是SNP标记还是InDel标记，一旦建立其HRM检测技术，该标记便可用于分子标记应用的各个方面，诸如遗传连锁图谱构建、关联分析、分子标记辅助育种、种质精准鉴定、种质DNA指纹图谱构建、杂交种纯度和真实性鉴定等。本研究开发的20对基于HRM检测技术的InDels标记可作为标记储备用于上述分子标记鉴定方面。由于InDel标记在基因组中呈共显性存在，且大多数位点只有两种基因型[4]，因此非常适合高通量检测和鉴定等方面的应用，其应用范围和前景非常广阔。