梓醇对衰老大鼠血管内皮细胞的保护作用研究

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人口老龄化是当前世界各国所面临的严峻挑战。如何延缓衰老是科学家们不懈探索的重大课题。增龄常伴随着血管结构和功能的改变，是动脉粥样硬化性心血管疾病发生和发展的危险因素之一。血管内皮细胞生物学改变是人类衰老和疾病的基础。近年来，细胞凋亡与衰老关系的研究已成为热点。现有的资料认为细胞凋亡与衰老过程中组织器官功能的退化、衰老相关疾病发生发展密切相关。梓醇(catalpol)是玄参科植物地黄的主要成分，是一种环烯醚萜类葡萄糖苷类化合物。含地黄的中药口服后有抗衰老、降血糖、利尿、强心、抗凝血、提高免疫力、抗肿瘤等作用[1-2]。目前梓醇对神经细胞及脑血管的保护作用有较多的报道[3-6]。而梓醇对衰老血管的保护作用研究相对较少。本研究通过建立D-半乳糖诱导的大鼠衰老模型，应用地黄提取物梓醇对衰老大鼠进行干预，旨在了解梓醇对衰老大鼠的血管内皮细胞的保护作用及相关机制，为临床应用梓醇防治血管老化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物 健康Wester清洁级3月龄雄性大鼠32 只，由山西医科大学实验动物中心提供(清洁级SXCK，2009-0001)，体重220 g±20 g。普通饮食适应性喂养1周后备用。

1.2 药品与试剂 梓醇，纯度≥98%，购自南京景竹生物科技有限公司，批号：A2002005；D-半乳糖购自源叶生物科技有限公司，批号：HA0426CA14；细胞凋亡原位检测试剂盒(In Situ Cell Death Detection Kit，POD)购自Roche公司；兔抗鼠Bcl-2、Bax及Caspase-3多克隆抗体均购自基尔顿生物科技(上海)有限公司；SYBR Green PCR试剂盒、逆转录试剂盒及BCA蛋白定量试剂盒为Thermo公司产品；PCR引物由上海捷瑞合成。

1.3 仪器 BIO-RAD公司Mini protean 3 cell型电泳仪，大连竞迈科技有限公司PS-9电转仪，MK3型芬兰雷勃酶标仪，OLYMPUS(CX41)公司正置显微镜，日本JEM1230透视电子显微镜。

1.4 方法

1.4.1 动物模型制备 将32只大鼠随机分为4组，每组8只。即正常组、衰老模型组(模型组)、梓醇低剂量组(低剂量组)、梓醇高剂量组(高剂量组)。衰老模型的制备参照文献[7-8]。除正常组外，其他3组大鼠均用D-半乳糖造模[100 mg/(kg·d) D-半乳糖腹腔注射]，正常组用同体积生理盐水皮下注射。

1.4.2 给药方法 6周后衰老大鼠造模成功。低剂量组及高剂量组分别采用不同剂量梓醇[5 mg/(kg·d)及10 mg/(kg·d)]，分别用生理盐水配制成3 mL液体腹腔注射，模型组与正常组均采用同等体积生理盐水腹腔注射。第18周末(12周后)每组随机抽取3只大鼠进行预实验，有阳性改变则结束实验。

1.4.3 标本采集 所有大鼠第18周末(12周后)取血待用，并去头处死后取主动脉备用。

1.5 观察指标

1.5.1 主动脉血管内皮细胞形态 取降主动脉段固定过夜，常规脱水，透明、浸蜡、包埋，制备石蜡切片，切片厚度约5 μm，进行HE染色，显微镜下观察主动脉结构及内皮细胞形态。另取2 mm×3 mm主动脉标本，用25%戊二醛2 mL固定，扫描电镜观察各组主动脉内皮细胞形态学特点。

1.5.2 主动脉血管内皮细胞凋亡率 取石蜡包埋的主动脉，采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT酶)介导的带荧光的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测。结果根据凋亡阳性细胞分布情况，每张切片拍摄10个阳性视野，每个视野记数30个内皮细胞中阳性细胞数，以平均计算阳性细胞所占的百分比作为细胞凋亡率(apoptotic rate，AR)。

1.5.3 细胞凋亡相关调控基因 将主动脉制成组织匀浆，离心后取上清液。免疫组化法检测细胞凋亡相关基因凋亡蛋白酶-半胱天冬酶-3(Caspase-3)蛋白；RT-PCR法检测B细胞淋巴瘤/白血病-2基因Bcl-2及Bax的表达。PCR引物由上海捷瑞合成，其他常规试剂均为国药产品分析纯。具体引物见表1。

表1 Bcl-2与Bax Real-Time PCR实验引物

2 结 果

2.1 梓醇对各组大鼠主动脉血管内皮细胞形态的影响 光镜下显示：正常组主动脉内膜光整，中层平滑肌细胞行走清晰，无增生。模型组主动脉内膜不光整，有细胞缺失表现，中层平滑肌细胞增生明显，排列紊乱。梓醇低剂量组及高剂量组上述病理损害均较模型组明显减轻，且高剂量组较低剂量组改善更为明显。HE染色后光镜下主动脉内皮细胞形态学改变详见图1。

正常组

模型组

低剂量组

高剂量组

图1 HE染色后光镜下主动脉内皮细胞形态学改变(×200)

2.2 梓醇对各组大鼠主动脉血管内皮细胞凋亡率及凋亡相关因子的影响 模型组细胞凋亡率明显高于正常组，梓醇低剂量组与高剂量组细胞凋亡率均明显低于模型组，且高剂量组低于低剂量组，差异均有统计学意义。模型组Bcl-2的表达量明显低于正常组，而梓醇高剂量组明显高于模型组，差异均有统计学意义；梓醇低剂量组Bcl-2的表达高于模型组，但差异无统计学意义；梓醇高剂量组Bcl-2的表达明显高于低剂量组，差异有统计学意义。模型组Bax的表达明显高于正常组，而梓醇高剂量组明显低于模型组，差异有统计学意义；低剂量组Bax的表达略低于模型组，但差异无统计学意义。模型组Bcl-2/Bax比值明显低于正常组，梓醇低剂量组与高剂量组均明显高于模型组，且高剂量组明显高于低剂量组，差异均有统计学意义。模型组Caspase-3蛋白表达明显高于正常组，梓醇低剂量组与高剂量组均明显低于模型组，且高剂量组低于低剂量组，差异均有统计学意义。详见表2。TUNEL图像详见图2。

表2 梓醇对各组大鼠主动脉血管内皮细胞凋亡率及凋亡相关因子的影响(±s)

正常组

模型组

低剂量组

高剂量组

3 讨 论

血管内皮的完整性和功能正常对维持血管壁光滑和血流通畅具有重要意义。衰老常伴随着血管结构和功能的改变，是动脉粥样硬化性心血管疾病发生和发展的危险因素之一。大量研究表明增龄是血管内皮细胞功能损害的独立危险因素。细胞凋亡是当今生命科学中最热的研究领域之一。随着衰老及其相关研究领域的进一步发展，人们逐渐认识到细胞凋亡在衰老方面的重要性，普遍认为细胞凋亡对细胞衰老起主要作用，并引起细胞特征性形态改变及衰老性生长停滞。细胞凋亡是一个细胞自我破坏的程序性生化过程，是多细胞生物体内的一个重要生命现象，既出现在个体发育过程中，也出现在正常生理状态或疾病中。细胞凋亡是在一定的生理或病理条件下，细胞遵循自身的程序，自己结束生命的过程，最后细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体，被其他细胞吞噬。一般来说触发凋亡信号转导途径可以分为外部死亡受体途径、线粒体途径和内质网途径。在这些途径中，很多基因及因素参与了影响及调控。Bcl-2是细胞凋亡抑制基因，名称来源于B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-celllymphoma/leukemia-2)，是目前发现的与凋亡关系密切的原癌基因。Bcl-2具有抑制细胞凋亡，延长细胞生存期作用，因而被称为长寿基因。Bax基因是Bcl-2家族的一员，其产物是一种与Bcl-2同源的相关蛋白，能够拮抗后者的生物学活性[9]。Bax的主要作用是加速细胞凋亡，细胞存亡决定于凋亡基因及凋亡抑制基因表达的多少。研究表明，Bcl-2及Bax两者间的比例较绝对量对于细胞、组织的影响更为重要，Bcl-2/Bax比值是决定细胞成活与否的关键因素。

细胞凋亡过程中，半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族充当了重要的角色。Caspase是一种具有特异天冬氨酸的半胱氨酸蛋白酶，是一组在细胞凋亡过程中起着关键作用的酶，是直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统，在细胞凋亡机制网络中居中心地位。Caspase家族是细胞凋亡过程中的关键元件，其激活与超常表达均引起细胞凋亡，因此又称死亡蛋白酶。在已发现的Caspase家族14个家族成员中，Caspase-3处于凋亡有序级联反应的下游，是最重要的效应型Caspase，是Caspase家族中的最重要和最关键的凋亡执行者之一，是细胞凋亡过程中的主要效应因子。正常状况下，胞质中的Caspase-3无活性，以Procaspase-3形式存在。当细胞接受凋亡刺激时，被系列反应激活，进而诱导细胞发生凋亡。因此，Caspase-3的表达不但反映细胞的凋亡水平，而且反映凋亡启动因素的存在。现在一般认为Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，也是细胞毒T淋巴细胞杀伤机制的重要组成部分，其活化是凋亡进入不可逆阶段的标志。

本研究观察到，利用D-半乳糖制造的衰老大鼠与正常组比较，主动脉血管内皮细胞形态学明显受损，细胞凋亡率明显增加，促凋亡基因Caspase-3及Bax表达明显增加，抗凋亡基因Bcl-2表达明显减少，特别是Bcl-2/Bax比值明显下降。说明衰老血管内皮功能的损害与细胞凋亡密切相关。

梓醇是中药地黄的提取物，现有的研究已经证实，梓醇具有抗氧化损伤、抗炎、抗癌、神经保护、利尿、降血糖、抗肝炎病毒、止血解痉等作用。目前，对于梓醇在神经系统方面的保护作用研究相对较多，有实验证实梓醇具有减轻脑缺血再灌注损伤及抑制脑细胞凋亡等神经保护作用[10-13]。然而，有关梓醇对衰老大鼠血管内皮功能的影响报道尚少。本实验显示：梓醇低剂量组与高剂量组均能改善D-半乳糖所致的衰老大鼠主动脉血管内皮细胞的形态学损害。同时，均能降低衰老所致的血管内皮细胞凋亡率，下调促凋亡基因Caspase-3的表达。梓醇高剂量组能显著上调抗凋亡基因Bcl-2及下调促凋亡基因Bax的表达。虽然梓醇低剂量组未能明显改变衰老大鼠主动脉血管Bcl-2及Bax的水平，但能明显上调Bcl-2/Bax比值。表明梓醇能明显保护D-半乳糖诱导的衰老大鼠的血管内皮损害，这种保护作用呈一定的剂量依赖性。梓醇对衰老血管的保护机制可能与其抑制血管内皮细胞凋亡有关。可见传统中药地黄提取物在抗血管衰老方面有良好的应用前景。