一株高效溶磷细菌MEC35的筛选鉴定及其多功能特性研究

陈 玲，马卫，许 银，倪 红

(湖北大学 生命科学学院，湖北 武汉 430062)

1 引言

磷、氮元素都是植物生长不可缺少的元素，研究表明我国土壤中总磷含量较高，但是大部分的磷会和一些金属离子结合成难溶性磷酸盐而难以被植物吸收利用[1]。植物每年都会从土壤中吸收大量的氮元素，造成土壤中氮元素含量降低。一般通过施加化肥来提高土壤中氮、磷元素含量，但是长期过量的施加化肥会导致水体富营养化，光化学烟雾污染,土壤板结[2]等问题，造成了大量的资源浪费和环境污染。而土壤中广泛存在的一种细菌—溶磷细菌(phosphate solubilizing bacteria)，简称PSB，能够通过自身代谢作用将土壤中的难溶性磷素(比如磷酸钙、磷矿粉等)溶解[3,4]，使其转化为易于被植物吸收利用的有效磷。PSB可以通过分泌有机酸结合金属离子从而释放磷酸根离子，或者通过分泌磷酸酶来降解有机磷从而增加土壤中磷含量[5,6]。利用溶磷菌增加土壤肥力对我国农业发展具有重大意义。陆瑞霞[7]等人通过溶磷圈法筛选出7株溶磷菌株，溶磷量在123.37～135.23 mg/L之间，都能分泌吲哚乙酸(简称IAA)；李显刚[1]等人通过溶磷菌圈法在百脉根部筛选出11株溶磷菌，各菌株溶磷量在 94.35 ～ 400.49 mg/L 之，大部分具有分泌IAA的能力；李玉娥[8]等人对5株溶磷菌的溶磷特性和分泌 IAA 能力进行研究，发现溶磷能力最强的溶磷量为300.3 mg/L，都有分泌 IAA 特性, 最大分泌量为 17.95 mg/L。本文从湖北某磷化工厂周边的土样中筛选到的一株高效溶磷菌MEC35，经鉴定为柠檬酸杆菌Citrobacter sp.，在28 ℃，180 r/min的条件下对磷酸镁、磷酸钙和磷矿粉的最大溶解能力分别是872.6315 mg/L、701.1873 mg/L和291.2195 mg/L，是一株高效溶磷菌，目前较多报道许多溶磷菌能分泌IAA，但能分泌吲哚乙酸(IAA)同时能固氮的溶磷菌很少有报道。MEC35能增加土壤中的有效磷含量，还能通过固氮作用增加土壤中氮的含量，且能够分泌IAA促进植物生长，具有增加土壤肥效，促进作物生长，增加坐果率等方面的应用潜力。

2 材料和方法

2.1 供试土样和试剂

供试土样采集于湖北某磷化工厂周边的土壤。所用的试剂：葡萄糖、酵母粉、甘露醇、苹果酸、二水钼酸钠、生物素、维生素B6、H2BO3、溴百里酚蓝以及其他常规试剂均为分析纯，购于国药化学集团化学试剂有限公司。磷矿粉为某磷化工厂的废渣。

2.2 培养基的配置

难溶无机磷培养基(PKO培养基)：葡萄糖 10 g、酵母粉 0.5 g、(NH4)2SO40.5 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·H2O 0.03 g、磷酸钙 5.0 g、蒸馏水 1000 mL，pH值7.0～7.5。

阿氏无氮培养基(Ashby)：甘露醇10 g，KH2PO40.2 g， MgSO4·7H2O 0.2 g， NaCl 0.2 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，CaCO35.0 g，蒸馏水定容至1 L。

无氮培养基( Nfb): 苹果酸5 g，KOH 4.5 g，K2HPO40.5 g， MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.02 g，NaCl 0.1 g，溴百里酚蓝 2 mL，Fe(3)-EDTA(1.64%) 4 mL，维生素溶液(VB6 200 mg/L，生物素 100 mg/L) 1 mL，微量元素(CuSO40.4 g/L，ZnSO40.12 g/L，H2BO31.4 g/L，二水钼酸钠 1 g/L，MnSO41.5 g/L) 2 mL。

Salkowski显色液：50 mL 35 % HClO4+1 mL 0. 5 mol/L FeCl3

2.3 实验方法

2.3.1 溶磷菌株的筛选

称取10 g的土样，添加到100 mL难溶无机磷液体培养基中，在 28 ℃、180 r/min条件下，摇瓶培养2 d，然后涂布于难溶无机磷固体培养基平板上于 28 ℃培养箱中，倒置培养7 d，每个处理重复3次，挑取溶磷圈较大的菌株，待鉴定[9]。

2.3.2 高效溶磷菌株的16S RNA鉴定

以筛选的菌株基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应混合液：金牌Mix(green) 45 μL、10 μM的上下游引物各 2 μL：1492R( 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') 和 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')、模板 1 μL，总体系为50 μL。涂布于含有1 μL/mL Amp的LB平板上37 ℃倒置培养10～16 h，挑取转化子，送到武汉擎科生物科技公司测序。将测序得到的结果跟ezbiocloud细菌数据库进行比对，并利用N-J法，和MEGA 6.0软件对该菌株进行系统发育树分析和鉴定，将筛选鉴定的菌株命名为MEC35。

2.3.3 MEC35菌株对五种不同难溶性磷酸盐溶解效果实验

将MEC35菌株活化过夜，按2%的接种量接种到含0.5%磷酸钙的PKO培养基中，于28 ℃ ，180 r/min条件下培养。每隔0、4、8、12、18、24、30、36、48、60、72 h取4 mL样品，于8000 rpm条件下离心 3 min，采用钼酸铵分光光度法测定(OD700)上清液中有效磷的浓度，以不加菌液的PKO培养基作为空白对照。以上每个处理重复三次。

同理，将PKO培养基中的磷酸钙分别换成相同浓度的磷酸铁、磷酸镁、磷酸铝、磷矿粉，按照上述方法，可以分别测出MEC35对这些无机磷的溶解效果。

2.3.4 MEC35菌株分泌IAA能力的测定

2.3.4.1 MEC35菌株分泌IAA能力定性测定

将单菌落过夜活化，按2%的接种量接入到含100 mg/L色氨酸的LB培养基中，于28 ℃、180 rpm条件下培养24 h，取100 μL菌悬液滴在96孔板上，再分别取含100 μL的10、30、50 mg/L IAA的溶液，滴在96孔板上作为阳性对照，以未接菌含100 mg/L色氨酸的LB培养基作为阴性对照。在上述样品中分别100 μL的Salkowski显色液，在室温下避光 30 min，观察其颜色变化，以确定菌株IAA分泌的强度[10]。以上每个处理重复二次。

2.3.4.2 MEC35菌株分泌IAA能力定量测定

IAA标准曲线的绘制：配制浓度为0～60 mg/L IAA梯度标准溶液，将IAA标液和Salkowski显色液等体积混合，室温下避光30 min(蒸馏水和Salkowski显色液等体积混合作为空白对照)，在530 nm下测定吸光值，以IAA浓度为横坐标，OD530为纵坐标绘制标准曲线[11]。

取5 mL在含100 mg/L色氨酸的LB培养基中培养24h的菌悬液，在8000 r/min下离心5 min，取2 mL上清液等比例加Salkowski显色液，混匀，室温下避光30 min 后立即测定OD530，根据标准曲线， 计算发酵液中 IAA含量(mg/L)。以未接菌含100 mg/L色氨酸的LB培养基作为对照。

2.3.5 MEC35菌株固氮能力测定

将MEC35菌液在NFB无氮培养基上进行划线培养[12,13]，分别以大肠杆菌和固氮菌(购买于中国工业微生物保藏管理中心CICC)作为阴性阳性对照，将正常生长的菌株送南京卡文斯生物技术有限公司测定其固氮能力。

将过夜活化的细菌MEC35，在8000 r/min条件下，离心3 min，用灭菌PBS洗3次，按2%的接种量接种于上述改良阿氏无氮液体培养基中，以不接菌作为对照，设3次重复，在28 ℃ 180 r/min的条件下培养15 d，过滤。参照国标HJ 636-2012采用全氮比色法[14]测定摇瓶培养液中的总氮含量，减去对照组中的氮含量即为菌株固定的氮量。

3 结果与分析

3.1 高效溶磷菌株的形态学特征和16S rDNA序列分析

溶磷菌株在含磷酸镁的难溶性无机磷培养基上的溶磷效果及该菌的革兰氏染色结果见图1。由图可见，溶磷菌在含磷酸镁的难溶性无机磷固体平板上溶磷圈直径平均为1.68 cm。菌落为圆形，呈白色，不透明，表面光滑、凸起、湿润，菌落边缘完整。在显微镜下观察菌株细胞形态为杆状，革兰氏染色为阴性，不产生芽孢[15]。

图1 溶磷菌溶解圈(A)、菌落形态(B)和革兰氏染色 (C)

将溶磷菌株的16S RNA进行测序分析比对，构建的进化树见图2。由图2可见，该菌株与Citrobacter youngae序列相似度最高为98%，结合MEC35的菌株形态特征、革兰氏染色和16S RNA序列的进化分析，初步判断菌株MEC35是一株柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)。

图2 MEC35基于16S RNA基因序列同源性的系统发育树

3.2 MEC35菌株对五种不同磷酸盐溶解效果实验

MEC35菌株对磷酸钙、磷酸镁和磷矿粉三种物质的溶磷效果见图3。由图可知，MEC35对磷酸钙的磷释放量最大，对磷矿粉的磷释放量最小。MEC35在0～10 h范围内对三种无机磷酸盐的溶磷量较低，随着培养时间的增加，在30 h左右，对三种磷酸盐的溶磷效果均达到最大，它们的溶磷浓度分别为 701.19 mg/L、872.63 mg/L、 291.22 mg/L。30 h后，随着培养时间的延长，溶磷量有不同程度的降低。

对磷酸铁和磷酸铝的最大溶磷浓度分别只为10.63 mg/L、19.65 mg/L，达不到国家《NY/T 1847-2010》标准(70 mg/L)，因此，该菌不能溶解磷酸铝和磷酸铁。

3.3 MEC35菌株分泌IAA能力的测定

通过定性检测MEC35菌株产生IAA实验，显色结果如图4 所示。由图可见，MEC35反应液为橘红色，说明具有分泌IAA的能力，根据阳性对照组，可得知MEC35分泌IAA的量在10～20 mg/L之间。根据IAA的标准曲线(图5)，测定出MEC35分泌IAA的浓度为16.53 mg/L，李显刚[1]等人分离得到11株菌株，它们分泌IAA的量在9.17～42.39 mg/L之间(除一株菌株不能分泌IAA外)。跟李显刚等人报道的结果相比，可知MEC35具有一定分泌IAA的能力。

图3 MEC35在不同时间内对不同无机磷溶解量

3.4 MEC35菌株固氮能力的测定

MEC35在NFB无氮平板上能正常生长，说明其具有一定的固氮能力。通过测定总氮标准曲线(图6)，测得MEC35在无氮培养基中培养15 d后，培养液中总氮浓度为20.137 mg/L，说明MEC35具有一定的固氮能力。

(1、2为50 mg/L的阳性对照，3、4为实验组，5、6为30 mg/L的阳性对照，7、8为10 mg/L的阳性对照，9、10为阴性对照)

4 讨论

以湖北某磷矿厂周边的土样为材料，筛选到一株高效溶磷细菌，经鉴定为柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)，命名为MEC35。实验表明，MEC35菌株对磷酸钙、磷酸镁和磷矿粉俊具有很好的溶解作用，同时该菌株还具有产IAA和固氮的能力。张亮[16]等人发现自生固氮菌能释放大量的氢离子，使培养基的 pH大幅度降低，使土壤无机磷活化。MEC35的固氮能力可以增加其溶磷能力，但MEC35菌株的溶磷机理还有待进一步研究。

图5 IAA的标准曲线

图6 总氮的标准曲线

IAA是一种植物生长激素，在一定浓度下能提高坐果率，提高农作物产量，MEC35具有产IAA的能力。因此，MEC35菌株有望作为生物肥料促进作物生长，修复土壤，提高土壤肥力等方面有着广泛的应用前景。