黑曲霉泡腾片制备工艺优化

唐婧红，范可帷，张 素，陈 雪，李 祝*，代园凤，张钦语，杨佩斯，赵妗颐，吉玉玉

（1.贵州省烟草公司毕节市公司，贵州 毕节 551700；2.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；3.四川省双流棠湖中学，四川 成都 610200；4.贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025）

农药泡腾剂是一种相对较新、发展较晚的特殊剂型[1]。它是由崩解剂（酸源和碱源）和各组分固体颗粒、粉体混合，经造粒或直接压制而成的药剂，它在水中能迅速崩解产生大量的CO2[2]。崩解后农药活性成分向周围扩散，这些活性成分接触到靶标作物后，能有效地发挥除草、杀虫或杀菌等方面的活性作用[3]。目前泡腾片在生产上的制备方法主要有5种，分别为酸碱分开湿法制粒[4]﹑干法制粒[5]﹑酸碱混合非水制粒[6]﹑直接压片和聚乙二醇包裹法[7]。泡腾片在医疗和饮用方面以有了广泛的使用，但在农药运用上时间并不长[8]。

虽然已有报道通过黑曲霉（Aspergillus niger）发酵液防治烟草青枯病[9]。但利用的是黑曲霉的代谢产物进行抑菌作用，而本研究是利用黑曲霉孢子粉进行抑菌作用，制备一种活菌泡腾片。黑曲霉孢子粉具有易贮藏、保藏费用低、可便于运输、不易污染、环境适应性强、直接投入发酵、发酵再生能力强等优势[10-11]。这种泡腾剂在使用时具有携带方便、省时、省力和高效等特点[12]。泡腾剂具有独特的优越性，符合现在农药剂型的发展趋势[13]。

因此，本研究采用粉末直接压片法制备黑曲霉泡腾片，以崩解时限、pH值、发泡量为评价指标，通过单因素试验和正交试验，对黑曲霉泡腾片的工艺参数进行优化，为将来黑曲霉的发展奠定良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

黑曲霉（Aspergillus niger）：贵州大学生命科学学院微生物教研室，保藏于中国典型培养物保藏中心（Chinacenter for type culture collection，CCTCC）），保藏号CCTCCNO：M206021。

1.1.2 试剂

柠檬酸（分析纯）：江苏强化功能化学股份有限公司；碳酸氢钠（分析纯）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）6000、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）、可溶性淀粉（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HPD-101-2A电热鼓风恒温干燥箱：常州市华普达教学仪器有限公司；YP-30手动液压压片机：鹤壁市创新仪器仪表有限公司；PHS-3C型酸度计：上海大普仪器有限公司；78X-Z型片剂四用测定仪：上海黄海药检仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 黑曲霉泡腾片的制备工艺

采用粉末直接混合压片法制备黑曲霉泡腾片。

技术要点：

（1）黑曲霉固态发酵物在65℃鼓风干燥箱中干燥24 h，粉碎，收集备用。

（2）将PEG乙醇溶液加入碳酸氢钠后混匀烘干，烘干温度低于60℃，避免温度过高碳酸氢钠受热分解。

（3）将含有PEG 6000溶液的碳酸氢钠烘干粉碎后，加入酒石酸、黑曲霉孢子粉和粘合剂，压片前须将原料和辅料充分混匀，避免压出的泡腾片颜色不均匀。

1.3.2 黑曲霉泡腾片制备工艺优化单因素试验

（1）泡腾片崩解剂种类及比例的确定

泡腾崩解剂由酸源和碱源组成[14]，常用的酸源有柠檬酸、酒石酸、苹果酸等；常用的碱源有碳酸氢钠、碳酸钠﹑碳酸钙等[15]。而酸源和碱源的选择会影响泡腾片的崩解时间、发泡量等。通过预实验对泡腾剂种类进行初步筛选。结果表明碳酸钙产气效果不好且在水中有沉淀，因此选用碳酸氢钠作为碱源。

选取黑曲霉孢子粉的添加量为10%，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）乙醇溶液质量分数为10%，添加量为7 g/mL，PEG 6000乙醇溶液质量分数为10%，添加量为3.15 g/mL，可溶性淀粉作为填充剂，碳酸氢钠作碱源，因为苹果酸吸湿性较强，所以分别以柠檬酸和酒石酸为酸源，采用粉末直接压片法制备黑曲霉泡腾片，以外观、黏冲情况为评价指标，选择最适酸源。

在选择最佳酸源的基础上，选择泡腾片崩解剂（酒石酸∶碳酸氢钠）比例为1.00∶1.00、1.00∶1.20、1.00∶1.25、1.00∶1.50，按粉末直接混合压片法制备黑曲霉泡腾片，测定其崩解时限及发泡量。

（2）润滑剂种类及质量分数的确定

分别以PEG 6000乙醇溶液、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮为润滑剂制备黑曲霉泡腾片，其他条件不变，观察泡腾片外观，选择最适润滑剂。

在选择最佳润滑剂的基础上，选用最佳润滑剂质量分数分别为7.5%、10.0%、12.5%、15.0%的PEG 6000乙醇溶液进行试验，观察泡腾片黏冲情况。

（3）粘合剂质量分数的确定

预试验表明，蔗糖溶液吸湿性较大，所以选用PVP粘合剂。选择聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液的质量分数为2.5%、5%、7.5%，按上述方法制备泡腾片，观察压片时模具的黏冲和泡腾片的外观。

（4）崩解剂添加量的确定

选择崩解剂的添加量为60%、65%、70%制备黑曲霉泡腾片，观察压片情况并测定其崩解时限。

（5）黑曲霉孢子粉添加量的确定

预试验表明，黑曲霉孢子粉的添加量会影响泡腾片的崩解时限，所以，需要选择合适的孢子粉添加量。选择黑曲霉孢子粉的添加量为10%、15%、20%、25%、30%，以外观和崩解时限为评价标准，确定泡腾片中孢子粉添加量的范围。

1.3.3 黑曲霉泡腾片制备工艺优化正交试验

在单因素试验的基础上，选取影响较大的3个因素崩解剂比例（A）、黑曲霉孢子粉添加量（B）、崩解剂的添加量（C）为考察因素，崩解时间为评价指标，选择L9（34）正交试验设计进行3因素3水平的正交试验，正交试验因素与水平见表1。

表1 黑曲霉泡腾片制备工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for preparation process optimization of Aspergillus niger effervescent tablets

1.3.4 检测分析方法

（1）发泡量的测定[16]

取一只烧杯，加200 mL水，投入泡腾片1 g，立即将所产生的气体导入一倒立、充满水的100 mL量筒中，至不再有气体产生时，记录量筒中气体的体积，即为发泡量。

（2）崩解时限的检查[17]

取1片泡腾片（3.5 g/片）于含200 mL水的250 mL烧杯中，水的温度为（25±5）℃。把泡腾片放入水中开始计时，等完全崩解时终止计时，即为崩解时限。同法检查6片，各片均应在5 min内崩解。如有1片不能完全崩解，应另取6片复试，均应符合2015版《中国药典》规定。

（3）pH值测定

取泡腾片3片，分别分散于100mL 20℃蒸馏水中，测定各溶液的pH值，结果取平均值。

（4）硬度测定[17]

取3片制得的泡腾片，采用片剂四用测定仪检查泡腾片硬度，将泡腾片放入仪器中，转动100次，取出，减失质量≤1%。如减失质量＞1%，应复测2次，均应符合2015版《中国药典》规定。

1.3.5 统计分析

使用SPSS v18.0数据统计软件对结果进行分析（n=3）。

2 结果与分析

2.1 黑曲霉泡腾片制备工艺优化单因素试验结果

2.1.1 泡腾片酸源的确定

以柠檬酸和酒石酸为酸源，制备黑曲霉泡腾片，观察其外观和黏冲情况，结果见表2。

表2 不同酸源制得的泡腾片的评价Table 2 Evaluation of effervescent tablets produced by different acid sources

由表2可知，酒石酸作为崩解剂的酸源时，表面较光滑且黏冲不明显，而柠檬酸作为崩解剂的酸源时，表面凹凸不平且黏模。因此选择酒石酸为最优酸源。

2.1.2 泡腾片崩解剂配比的确定

以酒石酸为泡腾片的酸源，碳酸氢钠为泡腾片的碱源，选取不同的崩解剂配比（酸碱比），测定其发泡量（CO2体积）与崩解时限，结果见表3。

表3 崩解剂配比对泡腾片发泡量和崩解时限的影响Table 3 Effect of disintegrating agent ratio on foaming amount and disintegration time-limit of effervescent tablets

由表3可知，随着酸碱比例的增大，发泡量先增多后减少，崩解时限先减小后增大。崩解剂的发泡量多、崩解时限短时，崩解剂较好。因此，崩解剂的最优配比为1.00∶1.20。

2.1.3 润滑剂种类的确定

用硬脂酸镁作为润滑剂，崩解剂溶解后有明显不溶物；用聚乙烯吡咯烷酮出片较顺利但崩解剂吸湿性较强；用PEG 6000所得颗粒较均匀，压片后溶解，未见不溶物。综合考虑，选择PEG 6000乙醇溶液作为润滑剂。

2.1.4 PEG 6000质量分数的确定

润滑剂PEG6000质量分数对泡腾片的影响结果见表4。

表4 润滑剂质量分数对泡腾片的影响Table 4 Effect of lubricant mass fraction on effervescent tablets

由表4可知，当润滑剂PEG 6000质量分数为10%时，所得泡腾剂的外观最好，且无黏冲现象，因此润滑剂最优质量分数是10%。

2.1.5 粘合剂质量分数的确定

PVP乙醇溶液质量分数对泡腾片的影响结果见表5。

表5 粘合剂质量分数对泡腾片的影响Table 5 Effect of binder mass fraction on effervescent tablets

由表5可知，添加质量分数为2.5%的PVP乙醇溶液时，片剂粘合较好、出片顺利且吸湿现象不明显。因此，选择PVP乙醇溶液的最佳质量分数为2.5%。

2.1.6 崩解剂添加量的确定

选择不同崩解剂的添加量，测定其崩解时限，结果见表6。

表6 崩解剂添加量对泡腾片崩解时限的影响Table 6 Effect of disintegrating agent addition on disintegration time-limit of effervescent tablets

由表6可知，随着崩解剂添加量的增加，崩解时间由56s变成52 s，崩解时限变短，所以选择崩解剂添加量为65%。

2.1.7 黑曲霉孢子粉添加量的确定

不同的黑曲霉孢子粉添加量对泡腾片外观及崩解时限的影响结果见表7。

表7 黑曲霉孢子粉添加量对泡腾片的影响Table 7 Effect of Aspergillus niger spore powder addition on effervescent tablets

由表7可知，随着黑曲霉孢子粉添加量的增加，崩解时限也随之增加。因此，选择孢子粉添加量为10%。

2.2 黑曲霉泡腾片制备工艺优化正交试验

2.2.1 正交试验结果与分析

以崩解剂比例（A）、孢子粉添加量（B）、崩解剂添加量（C）为评价因素，崩解时限为评价指标，进行正交试验，结果与分析见表8，崩解时限的方差分析结果见表9。

表8 黑曲霉泡腾片制备工艺优化正交试验设计及结果Table 8 Design and results of orthogonal experiments for preparation process optimization of Aspergillus niger effervescent tablets

表9 以崩解时限为评价指标的正交试验结果与方差分析Table 9 Results and variance analysis of orthogonal experiments using disintegration time-limit as evaluation index

由表9可以看出，以崩解时限为评价指标时，因素对崩解时限影响的主次顺序为B＞A＞C，即孢子粉添加量＞崩解剂比例＞崩解剂添加量，孢子粉添加量对崩解时限影响最大（P＜0.05），最优组合为A3B3C3，即酒石酸和碳酸氢钠比例为1.00∶1.25、孢子粉添加量为15%、崩解剂添加量为70%。

2.2.2 验证试验

用正交试验得出的最优配比A3B3C3制作泡腾片进行验证试验，得出黑曲霉泡腾片的pH为5.7，崩解时限为23 s，发泡量为40.79 mL/g，硬度（4.3 kg），优于其他试验组。

3 结论

在单因素试验基础上，经正交试验得出黑曲霉泡腾片的最优制备工艺条件为酒石酸与碳酸氢钠的比例1.00∶1.25，崩解剂的添加量70%，孢子粉添加量15%，质量分数为10%的聚乙二醇6000乙醇溶液为润滑剂、添加量为3.15 g/mL，质量分数为2.5%的聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液为粘合剂、添加量为7 g/mL。在此最优工艺条件下，制备的黑曲霉泡腾片pH为5.7、黏冲现象不明显，崩解时限（23 s）、发泡量（40.79mL/g）、硬度（4.3 kg），均符合2015版《中国药典》[17]的规定。