迷迭香酸在沙棘果酒中的应用研究

王 莹，刘凤霞*，王文庆，苏举一，薛 刚，皮 倩

（1.南阳理工学院 生物与化学工程学院，河南 南阳 473004；2.河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室，河南 南阳 473004；3.河南佳尚农业科技发展有限公司，河南 鲁山 467300）

沙棘果中富含沙棘黄酮、维生素C（vitamin C，VC）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等有保健作用的活性物质，具有抗衰老、抗氧化等作用[1-4]。沙棘果浆经发酵后制成的沙棘果酒营养成分丰富[5-6]，在发酵果酒时常添加60 mg/L的二氧化硫进行发酵。二氧化硫主要是抑菌、抗氧化，二氧化硫影响酒的质量，能与果酒中的色素结合，生成无色的加成产物对酒具有漂白作用，SO2可抑制苹果酸-乳酸发酵，许多果酒都要进行该反应，但酒中游离SO2对乳酸菌有强烈的抑制作用，而二氧化硫对该过程的抑制与游离二氧化硫浓度有关，当其浓度较低时，抑制作用较小，浓度高时，这一过程明显推迟，当浓度更高时，这一过程直接不能进行[7]。牛广财等[8]对沙棘果酒主发酵工艺的研究发现，沙棘中二氧化硫的最适添加量为80～120 mg/L。由于二氧化硫对人的健康存在一定的影响，需要研究新型的抗氧化剂添加到果酒发酵中。文献报道[9]在果酒中添加的新型抗氧化剂有乙二胺四乙酸二钠、植酸、茶多酚、竹叶黄酮等。迷迭香提取物中迷迭香酸的抗氧化作用最明显，而且与其他抗氧化剂相比，具有安全、稳定等优点，因此推荐其在食品中使用[10]。

本实验以沙棘果浆为原料，以不添加、添加抗氧化剂迷迭香酸或二氧化硫进行果酒发酵，并对果酒进行抗氧化性测定和澄清实验，为沙棘果酒发酵添加迷迭香酸取代二氧化硫作为抗氧化剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

活性干酵母：购自安琪酵母股份有限公司。沙棘果浆：北京汇源布尔津沙棘产业有限公司（新疆分公司）。8%迷迭香酸：河南佳尚农业科技发展有限公司。白砂糖、食用明胶均为市售食品级；果胶酶（5万U/g）：和氏壁生物技术有限公司。

二苯基苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH）、甲基红、亚甲基蓝等（均为分析纯）：国药集团上海化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

三联体低温发酵罐：实验室自制；1260型高效液相色谱（high efficiency liquid chromatography，HPLC）仪：美国安捷伦公司；LXJ-IIB低速离心机：上海安亭科学仪器厂；752N型紫外可见分光光度计：上海电分析仪器有限公司；HFM-0530中空纤维膜过滤设备（过滤孔径或截留分子量为100 kDa）：厦门福美科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 果酒生产操作要点

（1）沙棘原浆的离心：称取7.0 g明胶加入14 L果浆中，放入40℃烘箱中1 h，取出4 500 r/min离心10 min。

（2）发酵进程的工艺控制：其中一个罐中不加抗氧化剂，另外两个罐分别添加二氧化硫或迷迭香酸作为抗氧化剂。每罐白砂糖添加量为220 g/L，酵母添加量为0.2 g/L。

（3）控温发酵：主发酵温度控制为20℃，低温发酵温度控制为18℃。

（4）离心、过滤：发酵结束后4500r/min处理15min，得到清液后用截留100kDa分子质量的中空纤维超滤膜进行过滤。

1.3.2 果酒理化指标测定

（1）酒精度、总糖、还原糖、挥发酸、总二氧化硫和游离二氧化硫含量：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[11]进行。可溶性固形物含量：用手持糖量计测定；密度：用密度计测定。

（2）迷迭香酸含量测定：采用高效液相色谱仪测定，色谱条件为C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，4.6 μm），乙腈-0.1%磷酸溶液（40∶60，V/V）为流动相，流速0.6 mL/min，进样量10 μL，于波长330 nm处进行检测。

1.3.3 果酒抗氧化活性测定

按照文献[12-13]，分别采用DPPH法、普鲁士蓝法和水杨酸法测定沙棘果酒清除DPPH自由基能力、还原力和清除羟自由基的能力。

2 结果与分析

2.1 沙棘发酵过程中的理化指标变化

经离心的沙棘原浆分成3份，每份为3 L沙棘原浆加4 L水（调总酸（以酒石酸计）至6.0～6.5 g/L），加入220 g/L的白砂糖，0.2 g/L的酵母营养剂，其中两份分别加入750 mg/L的8%迷迭香酸粗品（相当于60 mg/L迷迭香酸）、120 mg/L的偏重亚硫酸钾（相当于60 mg/L二氧化硫），另一份不添加抗氧化剂。混合均匀后进行发酵。沙棘发酵过程中的理化指标变化见表1。

表1 沙棘果酒发酵过程中理化指标检测Table 1 Index detection in the fermentation process of sea buckthorn fruit wine

由表1可知，发酵至第10天时，3个发酵罐中，可溶性固形物由23 g/L降至8 g/L，密度由1.08 g/L降至0.99 g/L；加入迷迭香酸与不加抗氧化剂的发酵罐中还原糖、总糖含量均＜5 g/L。而加入二氧化硫的发酵罐中，发酵5 d时还有11.88g/L还原糖，说明二氧化硫对酵母发酵有一定的影响。

根据国标要求酒精度为12%vol～24%vol，挥发酸≤1.1 g/L，游离二氧化硫≤20 mg/L，总二氧化硫≤250 mg/L，所以3种方式发酵得到的沙棘果酒均在国标允许范围内。因此在沙棘果酒发酵时，添加迷迭香酸作为抗氧化剂替代二氧化硫，不会影响果酒发酵。

2.2 产品的抗氧化活性测定结果

（1）DPPH法测定沙棘果酒抗氧化活性

不同果酒对DPPH·的抗氧化实验结果见表2。由表2可知，各果酒浓度与DPPH·清除能力之间呈现较好的线性关系，对比不加抗氧化剂与加二氧化硫和迷迭香酸作为抗氧化剂的半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值可以发现，加迷迭香酸的IC50值最小，为8.02mg/mL。说明迷迭香酸清除DPPH·能力较二氧化硫要好。

表2 不同浓度果酒对DPPH的抗氧化实验结果Table 2 Effects of sea buckthorn fruit wine with different concentration on DPPH antioxidant capacity

（2）水杨酸法和普鲁士蓝法测定沙棘果酒抗氧化活性

分别取5个待测样各2 mL，利用水杨酸法和普鲁士蓝法测定果酒中总抗氧化能力的大小，测定结果如表3。

表3 不同方式发酵沙棘果酒抗氧化性测定结果Table 3 Determination results of antioxidant of sea buckthorn fruit wine with different fermentation methods

由表3可知，清除·OH的能力大小顺序为：迷迭香酸果酒（清除率99.31%）＞无添加抗氧化剂果酒（清除率98.83%）＞二氧化硫果酒（清除率98.67%）；还原力大小顺序为：二氧化硫果酒＞迷迭香酸果酒＞无添加抗氧化剂果酒。未添加抗氧化剂的沙棘果酒具有一定的羟自由基清除能力，分析原因是沙棘果酒原料中自身存在抗氧化剂成分，如维生素C、黄酮、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等。添加迷迭香酸的沙棘果酒具有较好的羟自由基清除能力及总还原力，迷迭香酸可以作为抗氧化剂替代二氧化硫进行使用。

3 结论

结果表明在沙棘果酒发酵时，添加迷迭香酸作为抗氧化剂替代二氧化硫，不会影响果酒发酵。

3种方式发酵果酒清除DPPH·的能力大小顺序为迷迭香酸果酒（IC50=8.02 mg/mL）＞二氧化硫果酒（IC50=10.31 mg/mL）＞无添加抗氧化剂果酒（IC50=11.47 mg/mL）；清除·OH能力大小顺序为迷迭香酸果酒（清除率99.31%）＞无添加抗氧化剂果酒（清除率98.83%）＞二氧化硫果酒（清除率98.67%）；还原力大小顺序为二氧化硫果酒>迷迭香酸果酒＞无添加抗氧化剂果酒。迷迭香酸可以替代二氧化硫作为抗氧化剂进行果酒酿造，从而避免二氧化硫对人类健康存在的影响。