EPO对全身炎症反应综合征大鼠急性肺损伤的治疗作用及机制

黄承，肖雪

(1 恩施州中心医院，湖北恩施445000；2 遵义医学院附属医院)

全身炎症反应综合征(SIRS)是由感染或损伤引起的一种临床综合征，全身性炎症介质释放、细胞通路激活等导致的细胞凋亡是其主要的促发因素[1]。急性肺损伤是SIRS患者最早出现和致死率最高的并发症[2]。促红细胞生成素(EPO)在多种哺乳动物中具有相同的序列和活性，是一种分子量为30.4 kDa，含165个氨基酸的糖蛋白[3]。EPO是第一个被发现具有造血作用的体液因子，在选择性EPO缺乏性疾病中，可用于外源性替代治疗[4]。研究发现，EPO具有细胞保护作用，可发挥抗凋亡、抗炎和免疫调节功能[5,6]。2015年2月～2017年1月，本研究观察了EPO对SIRS大鼠急性肺损伤的治疗作用，现分析结果并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康成年雄性SD大鼠24只，体质量180～200 g，购自第三军医大学大坪医院，动物许可证号：SCXK(渝)2012-0005。饲养环境：温度18～28 ℃、相对湿度40%～70%，光照12 h明暗交替；含蛋白质21%的饲料饲养，自由饮水。脂多糖(LPS)，北京索莱宝科技有限公司；重组人EPO(rhEPO)，哈药集团股份有限公司。ELISA试剂盒，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。

1.2 SIRS急性肺损伤模型制作及干预 所有大鼠分笼饲养2周，随机分为对照组、模型组、EPO组，每组8只。模型组及治疗组采用LPS二次打击法制作SIRS急性肺损伤模型：5%水合氯醛0.6 mL/100 g腹腔注射麻醉，麻醉完全后将大鼠仰卧位固定于鼠板上；钳夹双侧股骨中段致闭合性骨折，6 h后舌下静脉注射LPS 5 mg/kg。治疗组注射LPS后立即尾静脉一次性注射rhEPO 1 000 IU/kg，模型组和对照组尾静脉注射等量生理盐水。

1.3 相关指标观察 各组均于造模结束8 h麻醉，分离颈动脉，用无菌肝素化注射器抽取血液样本；放血法处死，无菌条件下取双侧肺组织。①一般情况：观察造模结束8 h内精神状态、反应、活动等一般情况。②血气分析：采用ABL80血气分析仪检测动脉血PaO2、PaCO2、HCO3-、pH。③血清高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、Bcl-2：采用ELISA法测定血清HMGB1、Bcl-2。④肺组织湿干重比值(W/D)：用吸水纸吸取左肺上叶表面的水分及血液后称重(T0)，烤干后再次称重(T1)，放入80 ℃电热鼓风干燥箱中烘烤48 h至恒质量后再次称重(T2)，计算W/D。W/D=(T1-T0)/(T2-T0)。⑤肺组织病理学观察：取右肺上叶，4%多聚甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片，HE染色。光镜下(×200)观察肺组织充血、水肿、损伤及炎症细胞浸润情况。

2 结果

2.1 三组一般情况比较 对照组精神状态好、反应灵敏、呼吸平稳、攻击性强，无死亡。模型组注射LPS 1～2 h出现呼吸急促，之后逐渐出现精神萎靡、嗜睡，被毛蓬松，寒战，呼吸急促(≥80次/min)，口唇紫绀明显，口、鼻及眼角分泌物增多，血尿，死亡2只。治疗组表现与模型组相似，但程度均较模型组减轻，呼吸频率≤70次/min，无死亡。

2.2 三组血气分析结果比较 模型组和治疗组PaO2、pH、HCO3-均明显低于对照组，但治疗组均高于模型组，组间比较P<0.05或<0.01。三组间PaCO2比较P>0.05。见表1。

表1 三组血气分析结果比较

注：与对照组比较，*P<0.05，△P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，●P<0.01。

2.3 三组血清HMGB1、Bcl-2水平比较 模型组和治疗组血清HMGB1水平均高于对照组，血清Bcl-2水平均低于对照组；治疗组血清HMGB1水平低于模型组，血清Bcl-2水平高于模型组；组间比较P<0.05或<0.01。见表2。

表2 三组血清HMGB1、Bcl-2水平比较

注：与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.05。

2.4 三组W/D比较 对照组、模型组、治疗组W/D分别为4.48±0.25、6.05±0.64、5.33±0.57，模型组、治疗组均高于对照组，但治疗组低于模型组，组间比较P均<0.05。

2.5 三组肺组织病理学变化 对照组：肺泡结构完整，肺泡间隔均匀一致，无炎症细胞浸润，肺泡腔内结构清晰，没有渗液。模型组：肺泡腔内广泛积气，肺泡结构破坏，肺泡腔内中性粒细胞浸润，部分可见灶状泡沫细胞聚集和不等量的红细胞渗出，形成弥漫性肺泡损伤；肺泡壁及肺间质毛细血管扩张充血，中性粒细胞粘附，部分肺泡壁增厚；肺间质及细支气管壁见慢性炎性细胞灶状浸润。治疗组：肺组织表现与模型组相似，但程度均较模型组减轻；肺泡结构部分破坏，肺泡腔内少量积气，部分肺泡腔内见泡沫细胞及纤维素渗出；肺间质小血管及肺泡壁毛细血管轻度扩张充血，中性粒细胞粘附；部分肺间质及细支气管内见慢性炎性细胞浸润。

3 讨论

目前认为，“二次打击”法制作急性肺损伤模型能较好地模拟临床急性肺损伤的发病机制，即多发性骨折或失血作为首次打击导致机体处于一种全身炎症反应状态，受到第二次打击会瞬间放大已经存在的炎症反应，使机体处于失控性炎症状态即SIRS，引起多器官功能障碍[7]。EPO是具有抗炎、抗凋亡和免疫调节等多功能的细胞保护因子，能通过抑制体内中心粒细胞氧化爆发、中性粒细胞活性和减少炎症介质释放而发挥抗炎作用。研究发现，酵母多糖诱导的休克模型大鼠给予rhEPO(1 000 IU/kg)可减少腹膜渗出，改善肾功能，在肠和肺组织中降低髓过氧化物酶水平，降低病死率[8]；对创伤性脑损伤诱发的急性肺损伤模型给予促红细胞生成素衍生物干预，能显著减轻肺损伤的病理学表现，降低肺组织W/D，减少肺组织内CD68+巨噬细胞聚集和TNF-α、IL-6、IL-1β表达[9]；EPO可通过抑制激活PI3K/AKT通路激活及糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)表达而抑制急性肺损伤的发生、发展[10～13]。PI3K可作为效应桥梁联系细胞内外信号，通过多种途径作用于其下游信号因子，发挥调节细胞凋亡的作用。PI3K/AKT通路介导的细胞凋亡是依靠Caspase-9和Bcl-2发起和调节的[14]。EPO可引起磷酸化作用和激活PI3K通路[15～17]。GSK-3β是AKT的上游因子，可参与糖原合成调控，促进细胞凋亡，减轻局部和全身炎症反应[18～21]。岳嗣凤等[22]研究显示，rhEPO可通过上调大鼠肺组织中Bcl-2蛋白表达，减轻支气管发育不良所致的肺损伤。Rocha等[23]报道，rhEPO对热损伤诱导的急性肺损伤大鼠有治疗作用，其作用机制可能与抑制GSK-3β/AKT通路活性有关。本研究治疗组一般情况、肺组组病理学表现、血气分析相关指标等均优于模型组，证实EPO可减轻急性肺损伤大鼠肺水肿、改善肺通气功能及代谢性酸中毒等。

急性肺损伤的主要病变特点为多形核白细胞正常凋亡途径发生障碍，同时肺泡巨噬细胞(AM)异常凋亡增加，肺泡上皮细胞过度凋亡等，即急性肺损伤时AM和肺泡上皮呈进行性凋亡状态[24]。Bcl-2是一种细胞凋亡抑制基因，通过对抗引起线粒体破裂的离子失衡，进而阻断细胞色素C释放，抑制Caspase活化，拮抗促凋亡基因，发挥抗氧化及维持细胞内钙稳态等作用，抑制细胞凋亡。有研究显示，rhEPO可减轻高氧所致的大鼠肺损伤，上调Bcl-2蛋白表达、抑制肺泡上皮细胞凋亡可能是其作用机制[25]。

HMGB1是新近发现的一种炎症因子，机体组织严重感染时会广泛表达。HMGB1有三个氧化还原亚型，分别为二硫键型、硫醇型和磺酰基型。二硫键型通过与细胞表面受体髓样分化蛋白2-Toll样受体4结合，促进TNF和IL-6释放，加重炎症反应；硫醇型与趋化因子受体12形成异源复合物，促进自噬基因1依赖的细胞自噬；磺酰基型通过内源性通路Caspase-9/3诱导细胞凋亡[26]。研究显示，LPS导致大鼠SIRS注射LPS 2 h后激活的单核/巨噬细胞释放HMGB1，6～12 h达到峰值，72 h开始下降，当临床症状改善后血清HMGB1水平逐渐恢复正常[27]。HMGB1的释放途径包括单核/巨噬细胞的主动分泌和凋亡细胞的被动释放，HMGB1长时间高表达主要与其释放途径有关[28]。血液和肺泡灌洗液中HMGB1水平升高可直接导致中性粒细胞浸润、肺泡出血、肺实质细胞损伤和炎性因子释放增加等。在注射LPS 2 h后给予抗HMGB1抗体能够显著降低脓毒症患者病死率[29]。Valdes-Ferrer等[30]研究显示，在脓毒症存活小鼠血浆HMGB1水平持续升高，可引起炎症性贫血，给予抗HMGB1单克隆抗体可显著改善贫血。本研究模型组和治疗组血清HMGB1水平均高于对照组，血清Bcl-2水平均低于对照组；治疗组血清HMGB1水平低于模型组，血清Bcl-2水平高于模型组；说明EPO可通过降低HMGB1水平、升高Bcl-2水平而减轻SIRS所致的肺损伤。

综上所述，EPO对SIRS诱发的急性肺损伤有治疗作用，其作用机制可能与下调血清HMGB1、上调Bcl-2有关。