苯并噻二唑处理提高低温贮藏期间马铃薯块茎抗病性及机制分析

朱艳，陈富，李生娥，葛向珍，刘耀娜

1甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070； 2甘肃省农业科学院马铃薯研究所，甘肃 兰州 30070；

3浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江 杭州 130018

前言

马铃薯（Solanum tuberosum）是我国主要的粮经作物之一，年产量近8000万吨，约占总产量70%的块茎采后需要经过长期贮藏，以供应翌年种薯及商品薯淡季销售[1]。但是，马铃薯块茎耐贮性差，由病原物侵染引起的侵染性病害是导致块茎采后腐烂的重要原因，其中由镰刀菌（Fusarium spp.）侵染引起的干腐病和细菌性软腐病是导致块茎窖藏期间腐烂的重要病害，给马铃薯产业带来巨大的经济损失[2,3]。目前，生产中主要通过低温贮藏化结合学杀菌剂的使用来控制采后腐烂，然而，化学杀菌剂的长期大量使用，会产生杀菌剂残留超标、病原菌抗药性增强、环境污染等一系列问题[4]。因此，寻求新型的、安全的、可替代或减少化学杀菌剂的病害防治方法十分必要。近年来，利用诱抗剂诱导植物自身抗病性的提高成为控制果蔬采后病害研究的热点。

苯并噻二唑（benzothiadiazol, BTH)是水杨酸的结构类似物，是第一个人工合成并商品化的诱抗剂，具有环境友好安全、诱抗效果广谱、理化性质稳定的特点，其本身无抑菌活性，但可作为重要信号分子，诱导多种植物的抗病性，在控制植物病害方面具有重要作用[5]。研究表明，BTH不仅可有效减轻小麦、花椰菜、辣椒、黄瓜、甜瓜和番茄等多种作物的田间病害[6-9]，还可控制多种果蔬的采后病害[5]。采用BTH真空渗透可减轻鸭梨果实的青霉病和黑斑病以及芒果的炭疽病[10,11]；BTH浸泡处理可有效控制桃的青霉病[12]，并抑制甜瓜的黑斑病、白霉病和粉霉病[13]。在马铃薯中的研究发现，BTH处理可诱导马铃薯对疮痂病的抗病性[14]，但鲜有BTH处理对马铃薯块茎低温贮藏中采后腐烂的控制效果及可能的抗病机理的报道。研究表明，植物抗病性的提高包括激活苯丙烷途径，提高植物防御酶如β-1,3葡聚糖酶（β-1,3-glucanase， GLU）、几丁质酶（chitinase，CHI）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、过氧化物酶（peroxidase，POD）和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）等活性[4,5]。因此，本研究采取不同浓度BTH采后喷施处理马铃薯块茎，分析低温贮藏期间BTH处理对块茎干腐病和细菌性软腐病的控制效果、抗病性相关酶活力及苯丙烷代谢相关产物含量的影响，以期为BTH在马铃薯块茎采后低温贮藏中病害防治的应用提供参考。

1.材料与方法

1.1 材料与试剂

试验马铃薯为陇薯10号(Solanum tuberosum Longshu No.10)，于2016年10月采收于甘肃省渭源县会川镇，块茎采后阳光下晾晒2h，装入网袋后当天运抵甘肃省农科院会川试验站，于低温（5±2℃，RH 75%～85%）的通风库中黑暗贮藏待用。

BTH (2,1,3-Benzothiadiazole) 为分析纯，购自Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 诱抗剂的制备

BTH 用0.01%Tween80（w/v）的无菌水配制，浓度分别为25、200ppm。

1.2.2 块茎的处理

挑选通风库中外观整齐，大小一致，无病虫害，无机械伤的马铃薯块茎，用2%（v/v）次氯酸钠溶液浸泡2 min，进行表面消毒后，在自来水下冲洗干净并于库内自然晾干后，然后随机将块茎分为3组，每组块茎90个，分别喷施25、200ppm的BTH溶液，使块茎表皮均匀接触BTH溶液，以喷施不加BTH的0.01%Tween80的无菌水为对照。块茎晾干后装入塑料网袋，立即入通风库贮藏。所有试验重复3次。

1.2.3 病情调查

分别于低温下贮藏第90天和180天，进行块茎的病情调查。参照包改红等[15的方法统计干腐病发病块茎数及发病程度。以块茎表面出现浅褐色水渍状稍凹陷病灶，指压后病组织可崩解判断块茎发生细菌性软腐病病害。分别根据公式（1）计算干腐病及细菌性软腐病的发病率，根据公式（2）计算两种病害的病情指数。块茎发生干腐病的严重度分级标准如下，0级：块茎表面无干腐病症状；1级：块茎表面有可视的轻度干腐病病斑；2级：10%～30%块茎表面有病斑；3级：30%～50%块茎表面有病斑；4级：大于50%块茎表面有病斑。块茎发生细菌性软腐病的严重度分级标准如下，0级：块茎表面无细菌性病害症状；1级：块茎表面有可视的轻度水渍状凹陷病斑；2级：10%～30%块茎表面有水渍状病斑；3级：30%～60%块茎表面呈水渍状病斑，薯块软化，指压后组织崩解，薯肉灰白色；4级：大于60%块茎表面呈水渍状病斑，薯块软化，指压后组织崩解，薯肉有脓状物，有恶臭味。试验重复3次。

1.2.4 指标测定

BTH处理后的块茎，分别于低温贮藏后第0、7、14、21、28和35天时，取块茎皮下2-3mm处组织3.0g，液氮速冻后，在－80℃下冷冻保存待用。参考李雪等方法[16]，测定总酚、木质素及PAL、PPO和POD的活性，参考刘晓佳等方法[17]，测定GLU和CHI的活性。总酚含量表示为△OD280nm· g-1 FW，木质素含量以OD280· g-1 FW表示。PAL以每mg组织蛋白在每ml反应体系中每min使290nm波长下吸光值变化0.05为一个酶活力单位（U）。POD以每mg组织蛋白在每ml反应体系中每min使470nm波长下吸光值变化0.005为一个酶活力单位（U）。PPO以每mg组织蛋白在每ml反应体系中每min使525nm波长下吸光值变化0.005为一个酶活力单位（U）。GLU以在37℃条件下，每mg组织蛋白每小时产生1mg还原糖为1个酶活力单位（U）。CHI以在37℃条件下，每mg组织蛋白每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的量为1个酶活力单位（U）。单位均为U·mg－1protein。指标重复测定3 次

1.2.5 蛋白含量的测定

参照Bradford 的方法[18]，以牛血清蛋白（BSA）为标准蛋白做蛋白标准曲线，计算提取液中蛋白含量。

1.3 数据分析

所有数据统计、标准差计算采用Excel2007软件，采用origin8.0进行绘图；数据的方差分析（ANOVA）采用SPSS 20.0软件，利用Duncan’s多重比较对数据的显著性差异进行分析，P＜0.05表示差异显著。

2.结果与分析

2.1 BTH处理对低温贮藏期间马铃薯块茎干腐病的影响

图1 BTH处理对低温贮藏后马铃薯块茎干腐病发病率(A)及干腐病病情指数(B)的影响

由图1可知，马铃薯块茎干腐病的发病率和病情指数随贮藏时间的延长逐渐增大。与对照组相比，BTH处理均可显著降低块茎干腐病的发病率（图1A）以及干腐病的病情指数（图1B）。低温贮藏后第90天，对照组干腐病发病率为33.33%，25ppm 和200ppm BTH处理组块茎干腐病的发病率分别为12.67%和20.67%，分别较同期对照组降低了61.99%和37.98%，而低温贮藏后第180天，对照组干腐病发病率上升至45.02%，25ppm和200ppm BTH 处理组块茎干腐病的发病率分别为21.67%和33.89%，分别较同期对照组降低了51.87%和24.72%（图1A）。低温贮藏后第90天，对照组干腐病病情指数约为16.67，25ppm 和200ppm BTH处理组块茎干腐病的病情指数显著下降，分别为5.11和7.78，而低温贮藏后第180天，对照组干腐病病情指数为38.33，25ppm和200ppm BTH 处理组块茎干腐病病情指数分别为11.67和16.23，分别较同期对照组降低了69.55%和57.66%（图1B）。

2.2 BTH处理对低温贮藏期间马铃薯块茎细菌性软腐病的影响

如图2所示，马铃薯块茎细菌性软腐病的发病率和病情指数随贮藏时间的延长逐渐增大，BTH处理可有效降低块茎低温贮藏中的细菌性软腐病的发病率（图2A）及病情指数（图2B）。低温贮藏后第90天，对照组细菌性软腐病发病率为12.67%，25ppm 和200ppm BTH处理组块茎细菌性软腐病的发病率分别为2%和6.67%，分别较同期对照组降低了84.21%和47.36%，而低温贮藏后第180天，对照组细菌性软腐病发病率为22.33%，25ppm和200ppm BTH 处理组块茎软腐病的发病率分别较同期对照组降低了74.65%和34.30%（图2A）。低温贮藏后第90天，对照组细菌性软腐病病情指数为4.44，25ppm 和200ppm BTH处理组块茎软腐病病情指数分别降至0.67和2.67，而低温贮藏后第180天，对照组软腐病病情指数为9.33，25ppm和200ppm BTH 处理组块茎软腐病病情指数分别为1.37和4.23，分别较同期对照组降低了85.33%和54.72%（图2B）。

图2 BTH处理对低温贮藏后马铃薯块茎细菌性软腐病发病率(A)及细菌性软腐病病情指数(B)的影响

2.3 BTH处理对低温贮藏期间马铃薯块茎抗性相关酶活力的影响

2.3.1 BTH处理对低温贮藏期间马铃薯块茎CHI和GLU活力的影响

如图3A所示，在低温贮藏期间，对照组马铃薯块茎CHI活性逐渐降低， BTH处理显著提高了块茎中CHI的活性。BTH处理后，块茎CHI的活性呈先上升后下降的趋势，在贮藏期间，其活力始终高于对照组。如图3B所示，在低温贮藏早期，块茎GLU的活力变化不大，但BTH处理后第14天，与对照组相比，25ppm BTH处理组块茎GLU显著升高，高于同期对照组酶活力的16.24%，200ppmBTH处理组块茎GLU活力变化不大。

图3 BTH处理对低温贮藏期间马铃薯块茎CHI(A)和GLU (B)活性的影响

2.3.2 BTH处理对低温贮藏期间马铃薯块茎PAL活力的影响

图4 BTH处理对低温贮藏期间马铃薯块茎PAL活性的影响

如图4所示，在低温贮藏期间，马铃薯块茎PAL活性逐渐升高，约在贮后第21天，达到一个高峰值后逐渐下降，BTH处理可提高块茎PAL的活性。贮后第21天，与对照组相比，25ppmBTH处理组块茎PAL活性可显著高于对照组12.24%，而200ppmBTH处理组块茎PAL活力变化不大。

2.3.3 BTH处理对低温贮藏期间马铃薯块茎PPO和POD活力的影响

图5 BTH处理对低温贮藏期间马铃薯块茎PPO (A)和POD (B)活性的影响

由图5A可知，与对照组相比，BTH处理可显著增加块茎中PPO的活力。在贮藏期间，对照组块茎PPO活性逐渐下降，至处理后第21天下降至一个稳定值后，基本保持平稳。而BTH处理组块茎PPO活力在处理后14天内逐渐升高，后快速下降，在处理21天后又表现出逐渐上升的趋势。但在整个贮藏期间，BTH处理组块茎PPO活性始终高于对照组的酶活，且25ppmBTH处理组对块茎酶活的提高水平稍高于200ppmBTH处理组的酶活。如图5B所示，在块茎贮藏期间，POD的活性呈先上升、后下降再上升、再下降的趋势。与对照组相比，BTH处理可显著提高块茎POD的活性，且低浓度的BTH处理效果更好。在贮藏第7和28天，25ppm处理组块茎POD活力分别较同期对照组高114%和136%。

2.4 BTH处理对低温贮藏期间马铃薯块茎总酚和木质素的影响

图6 BTH处理对低温贮藏期间马铃薯块茎总酚（A）及木质素（B）含量的影响

由图6A可知，对照组马铃薯块茎总酚的含量在贮后7天内快速下降，之后升高，至第14天达到一个高峰后下降，呈先下降、后上升再下降的趋势。BTH处理可缓解块茎中总酚含量的下降趋势，使其含量始终高于对照组。在处理后第7天，25ppmBTH和200ppm处理组块茎总酚含量分别高于同期对照组28.91%和7.81%。在处理后第14天，25ppmBTH和200ppm处理组块茎总酚含量分别高于同期对照组14.42%和7.21%。低温贮藏期间，马铃薯块茎木质素的含量逐渐升高，与对照组相比，BTH处理显著可提高块茎中木质素的含量 (图6B)。在处理后第7天，25ppmBTH和200ppm处理组块茎木质素含量分别高于同期对照组19.48%和4.03%。整个贮藏期，BTH处理组块茎木质素含量均高于对照组，且，25ppm BTH处理组块茎木质素含量水平高于200ppmBTH处理组木质素含量（第14天除外）。

3.讨论

作为水杨酸的类似物，BTH可诱导多种果蔬的采后抗病性，降低采后病害的发生[4]。而真菌性病害以及细菌性病害是引起马铃薯块茎贮藏中腐烂的主要病害，尤以干腐病[2]和细菌性软腐病引起的危害为重[3]。本研究结果表明，BTH采后喷施处理可显著减轻马铃薯块茎在低温贮藏期间干腐病和细菌性软腐病的严重程度，该结果与前人发现BTH处理可有效控制桃果实贮藏期间的青霉病发病率和杧果果实自然发病的病情指数等[19,20]结果基本相似。本研究还发现，BTH诱导马铃薯块茎抗病性的提高具有浓度效应，低浓度的BTH处理效果优于高浓度水平。

GLU和CHI具有降解真菌细胞壁中的β-1,3-葡聚糖和几丁质的作用，是植物防卫反应中重要的病程相关蛋白，植物被诱导产生这两种酶，则通常被认为能够增强对病原菌的抗病性[21]。本研究结果发现，BTH处理可提高马铃薯块茎的抗病性防御酶GLU、CHI的活力，这与前人在研究BTH 处理可诱导柑橘和砂糖橘果实中GLU和CHI活性提高的结果[17,22]基本相符。PAL、POD、PPO参与了植物苯丙烷代谢和木质素等代谢过程，PAL是苯丙烷代谢的关键酶，该途径的主要产物是多种酚类物质，不仅可抑制病原菌侵染植物，又是合成细胞壁中木质素的前体，总酚和木质素含量的增加，使植物对病原菌的抗性增强[23]。PAL、POD、PPO对增强对植物抗病性具有重要作用。已有研究表明，BTH处理能够促进相关果蔬中PAL、POD、PPO活力的增强，进而增强其抗病性[4,23]。本研究结果表明，BTH喷施处理后，块茎PAL、PPO和POD的活性被显著提高，并促使块茎内总酚和木质素等抗病性物质的积累。推测BTH通过诱导GLU、CHI、PAL、POD和PPO活力的增强，促进酚类物质和木质素的积累，增强马铃薯块茎抵抗病原菌侵染的抗性反应。