云南省鹤庆县首次在活鼠间发现鼠疫流行

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云南省大理州鹤庆县，位于云南省西北部，大理白族自治州北端，东经100。01′～ 100。29′、北纬25。57′ ～26。42′.滇西横断山脉南端、云岭山脉以东，东有金沙江与永胜县分津，南与宾川县接界，西与剑川县、洱源县接壤，北与丽江市毗连。总人口27万，有白、汉、彝、傈僳、苗、壮、纳西等22个民族，其中白族占总人口的56.76%。鹤庆县草海镇马厂村委会距县城28公里，平均海拔2900米，属高寒特困山区，全村辖18个村民小组，农户676户2 986人，农业生产主要以种植马铃薯。

鹤庆县于1772-1772年、1778-1796年、1879-1888年在东区(松桂、南庄、朵美、马耳山)有过3次较大的鼠疫流行。1888年后无流行报道[1]，已静息128年。1985年在马厂村(大马厂)、新蜂村(小马厂)狗血清和鼠血清中发现放射免疫阳性4份，1990年后开始每月在新蜂、马村进行鼠疫监测。2017年4月16日鹤庆县CDC鼠防人员在草海镇马厂村进行鼠疫常规监测时，用鼠笼捕获87只活鼠，通过解剖培养，其中2只鼠的肝、脾培养有疑似鼠疫菌菌落，送云南省地方病防治所复判，经过四步诊断、菌落PCR、免疫学等常规检测，实验结果均为鼠疫菌阳性，据此判定在鹤庆县草海镇马厂有鼠间鼠疫流行。为了进一步确定鹤庆县鼠间鼠疫流行强度和范围，于2017年4月24日至5月28日组织省、州、县3级专业机构联合调查组对鹤庆县草海镇马厂村及周边进行鼠疫扩大调查。

1 材料与方法

1.1调查范围 此次调查主要以草海镇马厂行政村(大马厂、竹兰井、黑泥绍)为中心，向周围的新蜂行政村(小马厂)、安乐行政村(安乐、沙子坪)放射状调查，方圆5公里范围。

1.2调查方式 主要通过入户访问，在村中和村周搜寻自死鼠，采集狗血清，用鼠笼捕获啮齿动物，所获材料进行血清学、病原学检测。

1.3鼠蚤鉴定 鼠及鼠体蚤用乙醚熏蒸后进行分类鉴定。

1.4活鼠健康状态及解剖病变观察 解剖前通过视觉对活鼠的神态、反应、活动、毛色等情况进行观察，判断健康状态；解剖时对皮下、淋巴结、胸腹腔积液、心、肺、肝、脾等病变情况进行观察。

1.5免疫学检测 用真空采血器采集狗血5 mL，活鼠股动脉放血，二者分别离心，分离血清做F1抗体检测；活鼠解剖取肝、脾，自死鼠取鼠鼷腺、心、肺、肝、脾、骨髓做F1抗原检测。抗原、抗体初筛检测阳性者均做三排复试(正反向血凝试剂盒，批号 20170201，由兰州生物制品研究所有限责任公司生产)。

1.6病原分离 活鼠取肝、脾分别接种在选择敏感培养基(批号20160813，购自北京陆桥技术有限责任公司生产)，置28 ℃培养箱培养观察3 d；蚤按三同(同地点、同鼠种、同蚤种)拉胃碾磨接种在选择敏感培养基，28 ℃培养观察5 d，发现可疑菌落，做两种温度(15 ℃、37 ℃)噬菌体裂解试验(鼠疫菌诊断用鼠疫噬菌体(批号 20161102)，兰州生物制品研究所有限责任公司生产)，鼠疫菌判定按鼠疫诊断标准(WS279-2008)执行。

2 结 果

2.1检诊检疫及自死鼠调查 5月1日-5月15日，通过一类及二类地区入户访问，共入户1 428户6 557人的接受调查，未发现原因不明的高热病人和急死病人，同时全县医疗卫生单位访问了门诊病人32 475人，排查发热病人533均未发现鼠疫疑似病人。4月23-30日，每天在大马厂、小马厂、竹兰箐、黑泥哨、新峰、安乐、沙子坪等村耕地及居民区巡查，投入专业人员455次、捕鼠员18人次、灭鼠员96次，踏查面积58 500亩，未搜寻到自死鼠、病鼠。

2.2流行范围 鹤庆此次流行病学调查了1个镇3个行政村6个自然村，查明鼠间鼠疫仅仅在草海镇马厂村委会大马厂自然村外100米耕地流行，方圆1公里左右。

2.3宿主及媒介 本次调查共有小型兽类2目3科5种，其中啮齿动物2科3属4种：大绒鼠(Eothenomysmiletus)，齐氏姬鼠(Apodemuschevrieri)，黄胸鼠(Rattusflavipectus)，社鼠(Rattusniviventer).食虫目有1科1属1种：臭鼩鼱(Suncus.murinus)。 本次调查主要媒介蚤类3科5属5种，分别为：方叶栉眼蚤(Ctenophthalmusquadrarus)，特新蚤指名亚种(Neopsyllaspecialisspecialis)，棕形额蚤(Frontopsyllaspadix)，缓慢细蚤(Leptopsyllasegnis)，不等单蚤(Monopsyllusanisus)。

共捕获354只活鼠，其中大绒鼠257只(72.6%)，齐氏姬鼠29只(8.2%)，其它19.2%。共分离鼠体蚤242匹，其中方叶栉眼蚤181匹(74.8%)，特新蚤指名亚种27匹(11.2%)，其它34匹(14.0%)。从生境上看，在耕地共捕获活鼠292只，其中大绒鼠257只(88.0%)，齐氏姬鼠29只(9.93%)，黄胸鼠4只(1.4%)，社鼠2只(0.6%)；而居民区捕获62只活鼠，其中黄胸鼠50只(80.6%)，臭鼩鼱9只(14.5%),社鼠3只(4.8%)(详见图1)。

在活鼠上共检获蚤242匹，其中野鼠染带蚤212匹，其组成为方叶栉眼蚤181匹(85.4%)，特新蚤指名亚种27匹(12.7%)，棕形额蚤3匹(1.4%)，不等单蚤1匹(0.47%)；居民区鼠染带蚤30匹，其中缓慢细蚤18匹(60%)，不等单蚤8匹(26.7%)，棕形额蚤2匹(6.7%)，特新蚤指名亚种2匹(6.7%)(见图2)。

图1 鹤庆县耕地和居民区宿主动物组成图Fig.1 The composition of the rodents in the cultivated land and the residential area of Heqing County

图2 鹤庆县耕地和居民区媒介组成图Fig.2 The composition of the vectors in the cultivated land and the residential area of Heqing County

2.4活鼠健康状态及解剖病变观察 捕获鼠均为活鼠，从外观上观察，活动自如，两眼有神，反应敏捷，毛发光亮，处于健康状态；解剖病变观察：皮下微充血，鼠鼷腺无肿大，胸腔、腹腔有少量红色积液，心、肺、肝、脾颜色正常，无肿大、无结节、无坏死。

2.5免疫学检测结果 共采集狗血清92份，鼠血清4份，血清F1抗体检测结果阴性，354只活鼠取肝、脾做F1抗原检测，阳性3份，其中肝脾抗原检测阴性材料中2份(32号、112号)细菌学检验为鼠疫菌阳性(见表1)。

表1 2017年云南鹤庆分离鼠疫菌信息表
Tab.1 Information of Yersinia pestis strains isolated from Heqing, Yunnan in 2017

菌株号分离地点宿主及媒介状态分离时间噬菌体试验反向血凝试验16北坡脚大绒鼠活2017.4.16阳性ND21北坡脚大绒鼠活2017.4.16阳性ND32北坡脚齐氏姬鼠活2017.4.24阳性-112西坡脚大绒鼠活2017.4.28阳性-146西坡脚大绒鼠活2017.4.28阳性1∶1280++153西坡脚特新蚤指名亚种活2017.4.28阳性ND161西坡脚大绒鼠活2017.4.28阳性1∶1280++164西坡脚大绒鼠活2017.4.28阳性1∶81920++125西坡脚特新蚤指名亚种活2017.5.1阳性ND139西坡脚方叶栉眼蚤活2017.5.1阳性ND

2.6细菌学培养结果 共捕获到活鼠354只，分离鼠疫菌7株，阳性率2.0%，其中自大绒鼠中分离到6株，阳性率1.7%；齐氏姬鼠中分离到1株，阳性率0.3%。鼠染带蚤242匹，分离到鼠疫菌3株，阳性率为1.2%，其中特新蚤指名亚种2株，阳性率0.8%，方叶栉眼蚤1株，阳性率0.4%。总之，此次从活鼠及染带蚤共分离到10株鼠疫菌, 均分离自鹤庆县草海镇马厂村(见表1)；部分菌株28 ℃噬菌体裂解图见图3。

图3 16号与21号在28 ℃下噬菌体裂解图Fig.3 Phage lysate figure of sample 16 and 21 at 28 ℃

3 讨 论

3.1鹤庆县草海镇马厂村鼠疫流行性质 从宿主、媒介调查结果上看与相邻县剑川、丽江野鼠鼠疫疫源地相似；对分离的鼠疫菌进行分子生物学和生化鉴定(行分子生物学和生化鉴定结果另文处理)，鹤庆县鼠疫菌株为野鼠鼠疫菌。因此本次鼠疫流行初步认为是以大绒鼠、齐氏姬鼠为主要宿主，特新蚤指名亚种为主要媒介的野鼠鼠疫流行[2-3]。

3.2 鹤庆县鼠疫流行特征

3.2.1与云南家、野两型疫源地菌株检出对象的差异 鹤庆县与剑川县鼠疫流行的表现形式差异较大，剑川1974年发现指示动物血清阳性，1975年从一只自死小林姬鼠分离到鼠疫菌[4]，其后1981-1991、1994、1997年从自死动物中分离到鼠疫菌，活鼠中均无发现[5]。丽江2005发生了严重的人间鼠疫流行，在随后调查的1 762份鼠类样本中除在27份自死鼠检测到3份鼠疫菌，其余均为阴性[3]，2006-2017年丽江发生多次野鼠鼠疫流行，期间也进行过大范围疫源调查，同样没有从活鼠中分离到鼠疫菌[6-8]，就连菌株毒力相对低一些的云南家鼠鼠疫1982年复燃以来，1000多个鼠疫疫点，绝大多数都是从自死鼠分离到鼠疫菌[9-11]，在鼠疫流行期间进行大量调查中，至今没有看似健康的动物体分离到鼠疫菌[3]，在几十年鼠疫常规监测及鼠疫流行好发季节的疫源调查均没有从活鼠中分离过鼠疫菌。然而就是在鼠疫工作者认为不可能的情况下，鹤庆县CDC在2017年4月16日进行鼠疫常规监测时，在用鼠笼捕获的87只活鼠中分离到鼠疫菌2株。其后开展了调查工作，在267只活鼠中再次分离到鼠疫菌5株，在鼠疫流行区及周边始终没有找到自死鼠和病鼠。

3.2.2鼠疫在活鼠间流行 鹤庆县CDC在常规监测中于2017年4月16日马厂北坡脚大绒鼠中检出2株鼠疫菌株，调查过程中又在4月24日马厂北坡脚齐氏姬鼠中分离鼠疫菌1株，28日马厂西坡脚分离4株，5月1日从媒介分离2株。从分离鼠疫菌时间上看鼠疫在不断蔓延，并波及大绒鼠和齐氏姬鼠2个种群，寄生蚤特新蚤指名亚种分离到鼠疫菌，说明完全具备了鼠疫在鼠间传播的条件[2-3]。因此，鹤庆县鼠疫并非是单纯的在自然界中存在被偶然发现，而是在局部范围内活鼠之间以流行的方式延续。这种能在活鼠间流行的方式是鼠疫流行的新发现，但能否在自然界中长期存在不得而知(因疫情处置使本次鼠疫流行终止)。假设这种能在活鼠间流行的方式长期得以延续，那么将会为长期困惑鼠疫工作者鼠疫的保存机制研究打开一扇窗。

3.2.3鼠疫菌对宿主的致病性较弱 鹤庆县在本次鼠疫流行区长期监测中并没有发现有自死鼠和病鼠现象，此次大范围搜寻同样没有发现，这与云南家野两型鼠疫流行时出现大量自死鼠完全不同[6-11]。甚至对捕获鼠的健康观察没有发现带病迹象，解剖观察，胸、腹腔仅有少量积液，脏器病变也不典型。说明鹤庆县鼠疫流行菌株对宿主动物的致病性较弱，只能形成轻微的菌血症，这在解剖培养时观察视野菌落比较稀少得到佐证。

3.3鼠疫菌免疫学的特殊表现 实验室检验时有2份脏器出现异常结果，反向血凝F1抗原检测阴性，细菌检测则为阳性(32、112)，用分离鼠疫菌(32、112)做反向血凝F1抗原检测则为阳性，这在其他鼠疫流行时期和动物试验中极少出现这种现象。通常反向血凝阳性检出率要高于细菌检出率[12]。有学者研究出现这样的结果是因为F1抗原在活鼠表达受抑制，一旦感染鼠死亡，则大量释放，用免疫学方法才可以检测出结果[13]。

3.4鹤庆县鼠疫流行对鼠疫防治工作的启示 1975年剑川县野鼠鼠疫疫源地的确立，1982年德宏州家鼠鼠疫的复燃，针对鼠疫防治工作政府出台了许多政策和防治措施，对鼠疫的防治起到了关键作用，1982-2017年期间虽然发生多起鼠疫流行事件，但每次都得到有效控制，历史悲剧没有重演，然而在长期鼠疫防治和监测工作中，有许多鼠疫工作者甚至鼠疫专家都认为鼠疫的发现主要是靠自死鼠或病鼠，常规监测是很难发现鼠疫流行的，基于这样的考虑，鼠疫监测任务逐年下降，单位鼠防人员配置减少，专业人员对活鼠的检验不够重视等现象，鹤庆县活鼠间鼠疫流行的发现给我们提出警示，鼠疫是可以在不致死宿主动物的情况下在活鼠间流行，同时细菌数量少，F1抗原含量低，如果工作中不认真，不仔细，就容易漏诊，因此应扭转鼠防人员对活鼠在鼠疫流行发现机会低的认识，在鼠疫流行相对静息时期应加强对活鼠的监测，拓宽对活鼠的检验类别，提高鼠防人员的责任心，以免漏诊。

(云南省卫计委陆林，云南省地方病防治所左仕富、高子厚、刘正祥、李玉琼、苏超、段兴德、浦恩念、吴鹤松等，大理州疾病预防中心罗建龙、陈建萍，张镜兰，大理市疾控中心余杰，洱源县疾控中心杨刘佳，祥云县疾控中心谢华敏，指导及参加了本次调查，在此表示感谢!)