参附强心合剂对心衰大鼠心肌能量代谢AMPK-PGC-1α通路的影响

周 凡 方 伟 祝光礼

心力衰竭是临床极为常见的危重症，是目前心血管领域非常重要的一项公共健康问题。调查研究[1-2]表明，国外人群中心力衰竭的得病率约为1.5%～2%，65岁以上人群得病率达到6%-10%，我国的得病率相比国外稍低，但也达到0.9%。心衰时心肌能量代谢发生改变，葡萄糖代谢和脂质异常，引起代谢循环代谢底物—游离脂肪酸（free fatty acids，FFA）逐渐增多，加重能量代谢障碍，损伤线粒体功能，AMPKPGC-1α通路在心力衰竭能量代谢重构中意义重大。本课题采用腹主动脉缩窄法制做心衰大鼠模型，以曲美他嗪为阳性对照，通过对血清B型脑尿钠肽（Brain natriuretic peptide，BNP）、FFA、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）及单磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、磷酸化 AMPK（phosphorylation ofAMP-activated protein kinase，P-AMPKα）、过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α（peroxisome pro-liferatorsactivated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α） 的检测，观察指标进一步明确参附强心合剂对心衰大鼠心肌能量代谢AMPK-PGC-1α通路的影响，以此阐明参附强心合剂对治疗心衰的机制。

1 实验材料

1.1 动 物 SD雄性大鼠，清洁级，体质量（140±10）g，由浙江省实验动物中心提供。动物质量许可证号：SCXK（浙）2013-0016。分笼饲养，保持室内恒温，温度（24±1）℃，相对湿度（55±5）%，通风 8～15 次/h，标准饲料，适应性喂养1周后进行实验。

1.2 主要药物 参附强心合剂（红参3g，附子5g，葶苈子10g，玉竹15g，煎煮浓缩成2g/mL的生药煎剂，由杭州市中医院制剂室提供）；盐酸曲美他嗪片（规格：30mg/片，批号2006150，施维雅制药有限公司生产）。

1.3 主要试剂 戊巴比妥钠（上海西堂生物科技有限公司，批号151121），BCA蛋白定量试剂盒（北京普利莱 GE公司，批号 PLL-2016-11），PVDF膜（杭州达文生物有限公司，批号R8AA4656C）、Anti-AMPK alpha 1抗体（abcam）、Anti-PGC1 alpha抗体（abcam）。

2 实验方法

2.1 动物模型及分组 选取雄性SD大鼠共60只，从中随机取8只作为假手术组，余为手术组。称重后根据每只大鼠的体质量分别用配置好的3%戊巴比妥钠（1mL/kg）麻醉。将麻醉后的大鼠固定于鼠板上，在腹部正中做一个约2cm的切口，钝性分离腹主动脉，沿腹主动脉找肾动脉分支，在该分支上方约2mm处将特殊处理的7号针头与腹主动脉用4号缝合线一起结扎，抽出探针，形成腹主动脉大约50%狭窄，同时腹腔内注射10万单位青霉素，关腹缝合。假手术组仅分离出腹主动脉，不行缩窄术。所有大鼠均喂予标准饲料，自由饮水。造模4周后，分别随机从假手术组与手术组中取6只大鼠共12只，采用眼眶采血法取血，检测血清脑钠肽水平以判定造模是否成功。

2.2 分组及给药 将造模成功且存活的40只大鼠，随机分为模型组（n=8），参附强心合剂高剂量组（n=8），参附强心合剂中剂量组（n=8），参附强心合剂低剂量组（n=8），曲美他嗪组（n=8）。于造模后第 5周开始药物溶液灌胃，每日定时灌胃一次。假手术组与模型组则用等量生理盐水灌胃；中药组参照陈奇主编的《中药药理实验方法学》[3]中关于动物与人体体质量折算表来计算，按60kg成人1天1帖参附强心合剂（共生药量33g），低、中、高各剂量1:2:4的比例来算，参附低剂量组为3.45g/kg，参附中剂量组为6.88g/kg，参附高剂量组为13.75g/kg。西药组参照陈淑云主编的《药理实验方法学》[4]中关于人与动物间体表面积折算的等效剂量比值表来计算，60kg成人1天服用曲美他嗪95mg，大鼠的等效剂量为曲美他嗪9.98mg/kg。给药时间4周。

2.3 标本的收集与检测 末次给药24h后处死大鼠，并取腹主动脉血、左心室组织等。采用ELISA法检测血清BNP、FFA、LDH含量；用Western blot法检测心肌组织AMPK、p-AMPK、PGC-1α蛋白含量，各蛋白至少重复3次。

2.4 统计学方法 应用SPSS19.0软件对数据进行分析统计，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，方差齐者，多组间采用one-way ANOVA，组间两两比较用配对零均值检验法；方差不齐者，采用Dunnett T3检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠BNP、LDH、FFA含量比较 与假手术组比较，模型组BNP、LDH、FFA水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各药物组 BNP、LDH、FFA水平均显著降低（P＜0.05）；其中，中药高剂量组 BNP、FFA水平与曲美他嗪组无显著差异（P＞0.05）；中药高、中剂量组LDH水平与曲美他嗪组之间无显著差异（P＞0.05）。见表 1。

表1 各组心衰大鼠血清BNP、LDH、FFA 含量（ng/mL，x±s）

3.2 各组大鼠AMPK、p-AMPK、PGC-1α表达比较

各组AMPK蛋白表达水平未见显著差异（P＞0.05）。与假手术组比较，模型组p-AMPK、PGC-1α蛋白表达显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，中药高剂量组p-AMPK蛋白表达与曲美他嗪组均明显增加（P＜0.01），中药高剂量组与曲美他嗪组之间未见明显差异（P＞0.05）；各用药组 PGC-1α蛋白表达均明显增加（P＜0.05），且中药各剂量组PGC-1α蛋白表达与曲美他嗪组之间无显著差异（P＞0.05）。见表2。

4 讨论

在中医古籍中并无“心衰”病名的记载，但总结其病因病机、症候，多归于中医“痰饮”、“心悸”、“喘症”、“水肿”等的范畴。原明忠老教授[5]认为，“心气虚”是心衰的根本原因和病理基础。马金等[6]总结临证经验，指出气虚进一步导致“阳虚”，终致心脉瘀阻，痰浊水湿内停。而心阳不能下温肾阳，心肾水火失济，致使肾虚不化，肾脉瘀阻，最终阳虚及阴，导致阴阳俱虚，阴不敛阳，阳气虚脱[7]。由此可见，益气温阳之法在心衰治疗中的地位。祝光礼教授在长期临床经验中，结合中医对心衰病因病机的认识，以益气温阳利水为立论，在历史名方参附汤基础上加入葶苈子与玉竹，立方参附强心合剂。原方参附汤源于《妇人良方》，功用回阳救逆，益气固脱；葶苈子可降气平喘利水，使水道通调，肺气清肃，玉竹滋阴养心，还可牵制附子，避免其助阳太过。现代研究[8]认为，参附注射液能够使心肌细胞的总腺苷酸池、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）、腺苷二磷酸（ADP）、磷酸腺苷（AMP）含量明显提高，具有保护心肌能量代谢的作用。另外，参附汤还能抑制参与心肌能量代谢的Ca-NFAT3信号转导通路活性，改善心功能。

表2 各组心衰大鼠AMPK、p-AMPK、PGC-1α半定量比值（ng/mL，x±s）

BNP是判定心衰的重要生化指标，LDH活性也是判断细胞坏死程度的重要指标之一。心衰时FFA利用减少造成心脏脂质沉积，发生脂质代谢异常，加重能量代谢障碍，损伤线粒体功能。在本次实验中，观察用血清Elisa法测定的各项指标发现，中药各组能降低BNP、LDH、FFA水平，且剂量越高降低幅度越大，其中BNP水平提示中药高剂量组与西药组作用相似；LDH、FFA水平提示高剂量和中剂量组与西药组作用相似。从该实验结果看，参附强心合剂可能通过减少心肌细胞坏死，加强游离脂肪酸氧化供能，改善脂质代谢，从而一定程度上改善心衰大鼠心肌能量代谢。

AMPK在机体内是重要的调控因子，是细胞能量变化感受器，可调节下游多组通路，调控细胞凋亡、能量代谢等进而影响机体各种疾病的发生与发展。在线粒体保护方面，AMPK可首先激活PGC-1α。PGC-1α是重要的促线粒体生物合成因子，能够调节线粒体数量和质量，参与脂肪酸氧化过程[9]。从本实验结果看，参附强心合剂可能通过激活AMPKPGC-1α作为参与线粒体生物合成及功能状态有关的信号通路，提高p-AMPK、PGC-1α的表达，降低血清FFA水平以调节脂肪酸氧化代谢及葡萄糖转运，改善心衰大鼠心肌能量代谢，减少FFA对内皮损伤作用，并促进线粒体生物合成。综上所述，参附强心合剂在一定程度上能够改善心衰大鼠的心肌能量代谢重构，从而起到治疗心衰的作用。