碱蓬修复黄河三角洲原油污染土壤试验研究

于一雷 ，马牧源 *，徐卫刚 ，郭嘉 ，李胜男

1. 中国林业科学研究院湿地研究所，北京 100091；2. 湿地生态功能与恢复北京市重点实验室，北京 100091

世界上很多重要湿地都分布有油田，如美国路易斯安娜油田、黑海油田、中国胜利、大庆、辽河和大港油田都位于湿地内。然而，石油开发过程中的落地油、漏油和溢油以及钻井泥浆和洗井废水排放等严重威胁着湿地生态系统安全（程国玲等，2007）。石油污染物会堵塞土壤孔隙，引起板结，改变土壤有机质与氮磷的比值（陆秀君等，2003），影响植物根系生理活动、抑制植物生长；与此同时，大多数石油污染物具有致癌、致畸和致突变作用（Jia et al.，2017；刘五星等，2006），进入土壤的石油污染物还会通过渗透作用污染浅层地下水（刘五星等，2006）。

黄河三角洲是中国最具代表性的滨海湿地之一，也是中国第二大油田——胜利油田的产油区，石油污染已成为本区湿地生态系统退化的重要影响因子（于君宝等，2012）。其中，孤东和胜坨油田等附近土壤（石油类含量大于500 mg·kg-1）（刘庆生等，2003；刘五星等，2007；王久瑞等，2002）和水体的石油污染较重（刘峰等，2012）。因此，开展植物对石油污染降解作用及过程的研究，对石油污染问题的解决以及湿地生态功能恢复具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 供试植物、原油、试剂和土壤

原油取自孤东油田，其组成为：饱和烃含量482 g·kg-1，芳香烃含量 27.8 g·kg-1，胶质 12.5 g·kg-1和沥青质11.4 g·kg-1。试验分析过程中的三氯甲烷、二氯甲烷和正己烷均为分析纯级，层析所用的试剂主要为硅胶和氧化铝（100～200目）。

土壤采自黄河三角洲背景值土壤（未受到石油污染），其基本理化性质为：pH7.60，全盐 5.74 g·kg-1，铵态氮含量 1.09 mg·kg-1，硝态氮含量 7.86 mg·kg-1，总有机质含量 4.14 mg·kg-1。土壤过 100目筛子后风干备用。供试碱蓬（Suaeda salsa）种子采自黄河三角洲。

1.2 试验设计

研究表明，上世纪 80—90年代黄河三角洲孤东油田土壤中石油污染的背景值为67.22 mg·kg-1，土壤中石油烃平均值为235.56 mg·kg-1（王景华等，1989；赵善伦等，1995）；2001年时孤东和胜坨油田附近土壤石油烃质量分数大于500 mg·kg-1，其中孤东油田土壤中石油烃质量分数最高值为 700 mg·kg-1（刘庆生等，2003）；2006年以来，研究发现油井周围100 m范围内土壤石油烃质量分数大多数高于500 mg·kg-1，溢油区油泥石油烃质量分数高达6320 mg·kg-1，油区土壤均遭受不同程度的石油污染，区域内受石油污染的土壤面积占总面积的24%（何庆成等，2006；王传远等，2009）。

植物对土壤中石油烃的降解作用受石油烃浓度影响较大，高浓度石油明显抑制植物生长及微生物活性，研究表明，当土壤中石油烃质量分数为40 g·kg-1左右时，其生物降解率接近最低（Almeida et al.，2013）。因此，基于黄河三角洲实际污染水平和前人研究结果，本研究设置3个石油污染水平，分别为2、4和6 g·kg-1，分别代表为低、中和高污染水平。盆栽用的花盆盆口直径和高度均为20 cm，每个花盆中装入4 kg风干土壤。首先将石油烃溶解至石油醚（沸点范围为30～60 ℃）中，再与土壤充分混合均匀，装入花盆，然后静置 2 d，期间多次搅拌，以使石油醚充分挥发。已有研究表明，将其置于室内通风橱中或在室外搅拌静置，均可使石油醚完全挥发（鲁莽等，2009；于君宝等，2012），排除石油醚的干扰作用。

供试植物为碱蓬，每个处理设置3个重复（表1），以未种植碱蓬的石油污染土壤作为对照处理，用于研究无植物作用下石油自然衰减特征。首先，精选碱蓬种子，每盆称取0.7 g，采用1%高锰酸钾溶液消毒半小时，然后用蒸馏水冲洗干净后播种（于君宝等，2012；Zhang et al.，2010）。在黄河三角洲东营市盐生植物园室外布置盆栽试验，2015年5月进行盆栽播种，出苗后10 d（幼苗相对茁壮之时）开始间苗和定苗，每盆保持 45棵。根据碱蓬不同生育期进行定量浇水，相同时期所有处理保持浇水量一致。每月测定碱蓬株高，采用直径为1 cm的微型半圆凿土钻采集根际附近土壤样品，用于理化性质和微生物种类分析。

表1 试验设计Table 1 The design of experiment

1.3 分析方法

土壤石油烃测定：称取风干土壤样品10 g，置于50 mL离心管中，加入30 mL三氯甲烷，加盖密封。摇动5 min，放置过夜。次日，置于55 ℃水浴中热浸，同时进行超声萃取，历时1 h，然后将离心管放入离心机进行高速分离（4500 r·min-1，离心5 min），过滤，收集上清液。重复热浸超声萃取2次，过无水硫酸钠，冷却干燥。依据石油天然气行业标准（SY/T5119—2008岩石中可溶有机物及原油族组分分析）（中华人民共和国国家发展和改革委员会，2008），利用层析技术对石油中烷烃、芳香烃和极性物质进行分离。通过正己烷连续润洗硅胶-氧化铝层析柱，将萃取后的石油过层析柱，其中极性物质被氧化铝吸附。层析柱用30 mL正己烷反复淋洗，然后收集淋洗出的烷烃组分，再用 30 mL（体积比为65:35）二氯甲烷与正己烷的混合试剂反复淋洗，收集芳烃组分，最后用30 mL三氯甲烷反复淋洗并收集极性物质，过无水硫酸钠，冷却干燥。采用称重法测定石油类污染物总量及各族组成含量。

微生物样品分析：现场采集土壤新鲜样品，立刻用液氮冷冻保存，然后用干冰保存样品送往实验室进行DNA提取，基于Miseq平台测序得到的PE reads，根据 overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样品后进行 OTU聚类分析和物种分类学分析。基于 OTU分析物种多样性指数以及对测序深度的检测；基于分类学信息，可以在各个分类水平上进行群落结构统计分析和可视化分析。

2 结果与分析

2.1 碱蓬株高变化

不同石油污染水平下盆栽碱蓬的平均株高变化见图1。由图可知，在3种石油污染水平下，盆栽碱蓬均萌发、存活且保持生长。

图1 碱蓬株高变化Fig. 1 The variation of Suaeda plant height

低污染水平（C1）处理6月碱蓬株高最低值为2.3 cm，10月最高值为60.0 cm，低污染水平处理的3个重复每盆株高生长趋势类似，但是8月后第一个重复（P2C1-1）平均株高高于另外两个重复。中污染水平（C2）处理6月碱蓬株高最低值为2.3 cm，10月最高值为15.0 cm。高污染水平（C3）处理 6月碱蓬株高最低值为 2.1 cm，最高值为 12.0 cm。中、高污染水平处理中各自的3个重复的株高变化趋势基本一致。低污染水平条件下碱蓬株高数据的变异系数为 96%，明显高于中和高污染水平（50%和53%），且后两者数值接近，低污染水平条件下变异系数高的原因在于第一个重复盆内有几株碱蓬株高明显高于其他碱蓬。6月份3种污染水平条件下株高无显著差异（P=0.329，0.103，0.423；n=3），7—10月低污染水平条件下的每盆株高均显著高于中（P=0.013，0.002，0.044，0.006；n=3）、高污染水平（P=0.001，0.001，0.035，0.004；n=3），其中，除7月份中污染水平的株高显著高于高污染水平株高外（P=0.008；n=3），其他月份均无显著差异。结果说明，碱蓬对石油污染土壤具有耐受或是降解能力，生长初期不同浓度石油对碱蓬株高影响不显著，生长后期中高浓度石油对碱蓬株高影响作用明显。

2.2 碱蓬生物量及主根系长度

盆栽碱蓬的生物量（干重）能反映其在不同石油污染水平条件下的最终生长状态。植物对污染物的降解作用主要集中在根系附近，生物量和主根长度均能反映碱蓬对石油污染的降解能力。不同石油污染水平处理条件下碱蓬干重和主根长度对比见图2。

图2 3种石油浓度处理的碱蓬生物量及主根长度Fig. 2 The biomass and main root length of Suaeda under three crude oil concentration treatments

低污染水平条件下碱蓬的生物量变化范围为16.79～166.00 g·pot-1，重复 1（P2C1-1）的生物量远高于其他两个重复是最明显的特点。这与图1中株高的变化是一致的。中污染水平条件下生物量范围为1.53～5.86 g·pot-1，高污染水平条件下生物量范围为1.61～2.55 g·pot-1。低、中和高污染水平条件下3个重复生物量变异系数分别为111、56和23，进一步说明低污染水平条件下生物量较大差异。低污染水平碱蓬生物量显著高于中和高污染水平的（P=0.030；n=3），且后两者之间无显著差异（P=0.958；n=3）。这表明中、高污染水平显著抑制了碱蓬生物量的增加。低浓度条件下重复1的主根系长度最大，达到13.9 cm，最低值为2.2 cm。3种污染水平处理的主根系长度平均值之间均无显著差异（P=0.130；n=3）。除去最高值之外，说明碱蓬根系能起到降解作用的平均深度在3.3 cm左右。石油污染水平升高明显抑制了生物量的增加，但是对根系没有起到明显影响作用，主要表现为对碱蓬地上部分的影响。

图3 不同处理中总石油烃浓度时间变化Fig. 3 The temporal variation of crude oil concentration in different treatments

2.3 石油烃浓度变化

2.3.1 总石油烃

为研究碱蓬对石油污染的降解效果，以无碱蓬种植（P0）的不同石油污染处理作为对照，分别设置3个对照处理。石油烃质量分数-时间变化见图3。

图4 不同处理中饱和烃和芳香烃浓度时间变化Fig. 4 The temporal variation of saturated hydrocarbon and aromatic hydrocarbon under different treatments

由图3可知，碱蓬处理中石油质量分数均低于对照处理，且表现为下降趋势。在8—10月，总石油烃质量分数降低幅度较大，这与碱蓬的快速生长变化是一致的。与对照处理相比，碱蓬均能显著降低土壤中石油总质量分数（P=0.001；n=3）。对照处理中总石油烃质量分数的降低可能是由于自然挥发或是土壤中微生物的降解作用所导致。扣除对照处理中自然降解的石油烃含量后，计算得到残留在低、中和高污染水平处理土壤中总石油烃质量分数分别为0.95、1.28和2.00 g·kg-1。进一步计算得出低、中和高污染水平处理下，碱蓬对总石油烃的降解率分别为47.5%、32.0%和33.30%。由此可知，在低污染水平条件下碱蓬对石油烃的降解效果最好，且中污染水平和高污染水平效果较为接近。

2.3.2 饱和烃、芳香烃、沥青质和胶质

饱和烃、芳香烃、沥青质和胶质为石油的主要组成部分。不同处理中石油组成分项的变化见图 4和图5。

图5 不同处理中沥青质和胶质浓度时间变化Fig. 5 The temporal variation of asphaltene and colloid concentration under different treatments

由图4可知，石油中各组分大小顺序为：饱和烃＞沥青质＞芳香烃＞胶质。对照处理中石油各组分均表现为降低趋势，这是由于自然挥发或土壤中微生物的降解作用所致。随着碱蓬的生长，降解作用明显，饱和烃和芳香烃的质量分数均明显降低。碱蓬处理中，低和中污染水平下饱和烃质量分数均表现为9月明显降低，10—11月时变化较为缓慢；高污染水平下 10月饱和烃质量分数明显降低。低污染水平条件下饱和烃降至0.78 g·kg-1，碱蓬对饱和烃的降解率为29.50%；中污染水平下饱和烃下降至1.87 g·kg-1，降解率为22.73%；高污染水平下饱和烃下降至2.04 g·kg-1，降解率为28.22%。芳香烃在总石油烃构成中的占比不是很大，但芳香烃却属于最难降解的部分。与对照处理相比，3种处理中芳香烃质量分数均降低，尤其是在中污染水平条件下7—9月急剧降低。低、中和高污染水平处理下，碱蓬对芳香烃的降解率分别为 38.61%、47.54%和30.89%。

图5所示为沥青质和胶质的时间变化特征。碱蓬处理中，3种石油污染水平下沥青质质量分数均明显下降，对照处理中低污染水平时沥青质变化不大，而在中和高污染水平下沥青质均明显降低，尤其是高污染水平处理。胶质方面，3种污染水平条件下胶质质量分数最终都降低至检测限，其中高污染水平石油处理的胶质质量分数基本上都在检测限以下。高污染水平处理下胶质的自然降解速率非常快。沥青质和胶质质量分数在 8—9月时出现明显降低。低、中和高污染水平下碱蓬对沥青的降解率分别为32.39%、51.96%和51.00%，这表明碱蓬对难降解的沥青质有较好的降解效果。

3 讨论

3.1 碱蓬生理特征与石油降解过程

综合碱蓬株高（图1）和总石油烃（图3）变化特征得出，5—7月时为碱蓬萌芽及缓慢生长期，8—9月为快速生长期，10月以后株高稳定，对应的土壤中总石油烃含量水平变化为缓慢降低、快速降低和缓慢降低 3个阶段，可以明显看出在碱蓬在快速生长期对石油烃的降解速率较快。于君宝等（2012）研究表明，石油对碱蓬幼苗株高和叶片数的影响显著，石油污染水平越高抑制作用越明显。其研究结果可解释本研究中前期的缓慢增长，以及后期相对减弱的抑制作用。幼苗期后碱蓬可通过增加抗氧化酶、增加叶绿素含量等提高对石油逆境的抵御能力（高乃媛等，2013）。与碱蓬同属于藜科（Chenopodiaceae）的盐生植物海蓬子（Salicornia europaea）对盐碱土壤中的原油污染具有较高的降解率，且优于单独的铜绿假单胞菌降解处理（Ebadi et al.，2018）。另外，也有研究开展重石油污染浓度（高达47.1 g·kg-1）的植物降解试验，结果表明植物均显示出高生存率和活力，但并未显著提高总石油烃降解效果（Pérez-Hernández et al.，2016）。

根系在降解过程中起主要作用，根系本身及其附近微生物的协同促进作用使得根际附近的石油烃降解效率高（鲁莽等，2009）。本研究中除一个重复的主根系长达13.9 cm之外，平均根系长度为3.3 cm，说明该长度为碱蓬降解的主要深度范围。有研究发现，在石油烷烃降解过程中，烷烃在碱蓬中的分布特征表现为根＞茎＞叶，且初期根系的富集能力较强，后期有所降低（高乃媛等，2013）。碱蓬生长进入花果期后，其根系生长变慢，吸收作用减弱，相应地，降解能力也减弱（王蓓等，2007）。许崇彦等（2007）研究发现，与对照相比，碱蓬对盐碱土壤中石油烃的降解率为 21%～37%。本研究结果低石油污染水平下的降解率为47.5%，中水平下为32.0%，高水平下为33.30%。对比发现两者降解效率比较接近。海蓬子与铜绿假单胞菌接合措施显著提高了降解率，其中对长链烷烃（C20以上）的降解强度最大（Ebadi et al.，2018），虽然植物和菌种类型不一致，但其结果与本研究中碱蓬对烷烃降解作用较大的结果一致（图4～图5）。

3.2 根际微生物

由图6(a)可知，在低、中原油污染水平下，碱蓬处理的香农指数略高于对照处理，但是均并未达到显著水平（低：P=0.918，n=3；中：P=0.584，n=3）；高污染水平下碱蓬处理的香农指数低于对照处理，差异未达到显著水平（P=0.209；n=3）。王梅等（2010）研究表明，低石油污染有可能刺激了细菌数量的增加，随着浓度升高，微生物多样性会降低。本研究中，石油污染水平的变化对优势种群的影响较小。低、中污染水平处理中细菌多样性的增加，在于碱蓬根系附近的输氧作用以及根系分泌物养分作用的影响；高污染水平处理的环境胁迫作用导致碱蓬根系附近细菌多样性降低。这也说明碱蓬对原油的降解作用可能与微生物共同起作用。

图6 不同处理土壤中微生物Shannon指数和微生物相对丰度Fig. 6 Microbial Shannon index and relative abundance of microorganisms in soils under different treatments

由图6(b)中可知，所有处理中Proteobacteria（蛋白菌，属于变形菌）相对丰度均较高，丰度为30%～40%；Chloroflexi（绿弯菌）丰度为20%左右，Actinobacteria（放线菌）为15%左右，Acidobacteria（酸杆菌）丰度为 15%左右。碱蓬处理并未显著提高土壤微生物丰度。低污染条件下：与对照相比，Proteobacteria相对有所降低、Chloroflexi（绿弯菌）变化不明显、Sacchairbacteria升高、Actinobacteria略微升高。中污染条件下各细菌相对丰度变化不大。高污染条件下：Acidobacteria丰度降低、Sacchairbacteria丰度升高、Actinobacteria丰度降低。高污染条件下碱蓬处理中 Mycobacterium、C1-B045显著低于对照，而Desulfuromonas则高于对照。

在胜利油田滩涂区，韩平等（2009）筛选出对石油烃降解率大于90%的γ-变形菌，它能降解大部分C12～C26的石油烷烃。在胜利油田采油井附近的砂质壤土中也发现变形菌为其优势菌群（Liao et al.，2015；Gao et al.，2015），与本研究结果一致。有研究发现，α-变形菌纲红螺菌是石油污染土壤中的优势菌，且在好氧环境下是降解多环芳烃的优势菌（Zhang et al.，2012）。土壤环境的差异，造成能降解石油污染的土著菌群明显不同，在尼日利亚三角洲污染场地中发现，除变形菌外还有8种降解细菌属（Chikere et al.，2017）；从阿尔及利亚瓦格拉市砂质土壤中分离出链霉菌属，发现7 d内其对石油的去除率达到98%，其中对正构烷烃（C6～C30）、芳族和多环芳烃的降解率高，同时此菌株还能促进植物生长（Baoune et al.，2017）；在尼日利亚污染超过 10年的原油井周边筛选出的根际真菌与大黍（Panicum maximum Jacq.）对总石油烃的协同降解率达到40%（Asemoloye et al.，2017）。也有研究表明，盆栽条件下微生物增强根际的处理与非根际和对照相比，土壤脱氢酶活性增加，且明显提高了对总石油烃、芳香烃的降解效果（Dhote et al.，2017）。

3.3 石油降解的指数拟合

运用一级衰减方程Nocentini et al.（2000）来描述土壤中总石油烃含量的降解速率，基于Origin分析软件，扣除对照处理的石油烃自然衰减含量后，对碱蓬在3种污染水平条件下的石油降解过程进行非线性指数回归模拟，结果见图7。

3种浓度下碱蓬对总石油烃降解的拟合曲线的R2分别为0.99、0.97和0.70，降解速率常数K分别为0.19、0.12和0.11。3个曲线拟合结果均较好，其中低污染水平下的拟合效果最好，降解速率常数最高。由此表明，高污染条件下，石油烃对碱蓬的胁迫作用强，而低污染条件下胁迫作用较弱，因此碱蓬及根际微生物对石油的协同降解效果较好（许崇彦等，2007；Liste et al.，2000）。

4 结论

图7 石油烃降解的非线性指数回归拟合Fig. 7 Nonlinear index regression fitting of crude oil degradation

室外盆栽条件下碱蓬在原油污染水平为 2～6 g·kg-1的土壤中均能萌发、存活和生长，且低水平时株高、生物量及主根系长度高于其他水平处理。5—7月时为碱蓬缓慢生长期，8—9月为快速生长期，10月以后株高稳定。同时，土壤中原油含量水平变化分为缓慢降低、快速降低和缓慢降低3个阶段，与生长期具有一致性。碱蓬在快速生长期对原油的降解速率高，其中碱蓬根际为主要降解作用发生区。

低、中和高污染水平处理下碱蓬对石油烃的降解率分别为38.61%、47.54%和30.89%，其中对原油中饱和烃的降解作用较大。试验处理中变形菌的丰度最高，其次为绿弯菌、放线菌和酸杆菌，均为降解石油烃菌群。高污染水平石油烃对碱蓬的胁迫作用强，而低水平胁迫作用较弱，同时碱蓬及根际微生物对石油的协同降解效率高。碱蓬处理并未显著提高土壤中微生物的丰度，但是碱蓬与微生物可能起到协同降解作用，具体机理需要进一步研究。