自然杀伤T细胞在血管紧张素II诱导的高血压中的作用

侯翠柳 陈 东 来 松 刘 洋 田 翠 杨 慧 王红霞

原发性高血压(primary hypertension, PH)是以体循环动脉压升高为主要临床表现的心血管综合征，通常简称为高血压[1]。高血压与其他心血管病危险因素共存，是重要的心脑血管疾病危险因素，可损伤重要脏器如心、脑及肾的结构和功能，最终导致这些器官功能的衰竭[2]。目前关于PH的发病机制尚不清楚，认为是遗传、环境及神经内分泌因素共同作用的结果。近年来大量研究表明高血压是一种慢性炎症性疾病，且越来越多研究表明炎症反应尤其是免疫细胞在高血压及其靶器官损害的过程中具有重要的作用，如高血压和高盐可促进免疫细胞包括单核/巨噬细胞和T 淋巴细胞等在血管壁中聚集和活化，产生大量氧自由基(reacive oxygen speaes,ROS)和炎症因子，进而促进血管重塑和高血压发生[3]。Harrison实验室发现RAG-1-/-小鼠(缺乏T和B淋巴细胞)可明显抑制Ang II 和DOCA-salt诱导的高血压，通过特异性过继性T淋巴细胞转移可完全恢复血压，而B淋巴细胞没有上述作用[4]。上述研究表明，T淋巴细胞介导的免疫反应参与高血压的发生[5]，但何种类型的T淋巴细胞参与高血压的发生目前尚不清楚。

自然杀伤T细胞(natural killer T cells, NKT)细胞是一类新的T细胞亚型，既表达T细胞受体(TCR)αβ，又表达NK细胞表面标志的T细胞亚群。其能识别由抗原提呈细胞表面CD1d分子提呈的脂类抗原如(α-GalCer)[6]，因此CD1d的敲除导致NKT细胞的失活。 NKT细胞活化后迅速分泌大量细胞因子从而调节机体的免疫应答，从而在抗肿瘤、抗感染、抑制自身免疫性疾病及移植耐受中发挥重要的作用[7]。除此之外，研究还发现NKT细胞还参与了多种心血管疾病的发生，如NKT细胞调节动脉粥样硬化的发生、其激活保护心肌细胞免受柯萨奇病毒B3引起的心肌损伤、拮抗心肌缺血/再灌注和心肌梗死的发生等[8]，但其在高血压发生发展中的作用尚不清楚。

本实验通过在CD1d基因敲除的小鼠上，采用血管紧张素II灌注14 d建立小鼠高血压模型，观察小鼠血压、血管壁厚度、炎症反应及纤维化及巨噬细胞的浸润，探讨NKT细胞在高血压中的作用及分子机制。

材料与方法

1.实验动物 C57BL/6J小鼠，雄性，6 ～8周龄，18～20 g，由北京维通利华公司提供。CD1d基因敲除(CD1d knockout, CD1d ko)购自Jackson Laboratory小鼠(129S2/SvPas)。所有实验动物均饲养于首都医科大学 SPF 级实验动物房。所有研究工作均遵守美国国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth,NIH)制定的《实验动物管理及使用指南》，并经首都医科大学实验动物管理委员会批准。

2.主要试剂 Angiotensin II、三溴乙醇、丽春红粉剂、苯胺蓝粉剂、磷钼酸/磷钨酸均购于美国Sigma公司；苦味酸、碳酸氢钠购于北京化工厂；反转录试剂盒购于美国Progame公司；流式管，计数板、CD45-Perpcp抗体、F4/80-BV421抗体购于美国BD公司。

3.主要方法 (1)实验分组、模型制备及给药方法：CD1d 基因敲除(CD1d ko)及C57BL/6J野生对照雄性小鼠(wild type, WT)分别随机分为 4 组(每组 8 只)：对照组WT+ Saline、CD1d ko+Saline；实验组WT+Ang II、CD1d ko+Ang II。模型制备过程：小鼠称重，计算 Ang II(490ng·min-1·kg-1)所需剂量，根据剂量在超净台下灌泵。用3%的三溴乙醇溶液腹腔注射麻醉小鼠，常规消毒实验组小鼠耳后部皮肤，剪开1cm长的切口，将泵(开口端朝向鼠尾侧)埋入浅筋膜下层。缝合皮肤，严密观察小鼠生命体征，待小鼠生命体征平稳后隔天用无创鼠尾法监测小鼠血压持续14 d。

(2)血管取材与染色：小鼠麻醉后打开胸腔进行心血管体循环系统灌注，剪取小鼠胸主动脉，用滤纸吸干血管表面的水分，用于提取 RNA的组织用液氮冷冻后保存于 -80 ℃冰箱。用于病理检查的血管在甲醛中固定，然后石蜡包埋、切片，脱蜡后进行HE和Masson染色。

(3)实时荧光定量 PCR实验：Trizol 法提取小鼠血管组织 RNA，反转录获得 cDNA。每个体系加入 2 μL cDNA 模板、上下游引物各 1 μL 和 SYBR10 μL，配制成 20 μL 的反应体系。通过实时荧光定量 PCR 仪测定IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的 mRNA水平。IL-1β 的上游引物为 5’-TTGGGCCT-CAAAGGAAAGAAT-3’，下游引5-TGGGTATT-GCTTGGGATCCA-3’; IL-6 的上游引物为 5’-CCA-GAAACCGCTATGAAGTTCCT-3’，下游5-AGAACCCTGACTACGACCAC-3’; TNF-α 的上游引物为 5’-GCCAACGGCATGGATCTC-3’，下游引物为 5-GCAGCCTTGTCCCTTGAAGAG-3.

(4)流式细胞术：配制血管消化酶，剪取小鼠的整根主动脉，修剪血管周围多余的脂肪组织，然后将血管放到装有PBS的1.5mL EP管中，置于冰上剪碎小鼠的血管组织，每组的操作尽量保持一致性，随后将剪碎的血管组织转移至装有消化酶的EP管中，不断消化，直至血管组织被完全消化成单细胞悬液，过滤至新的15mL离心管中，除去其杂质。将上述过滤好的血管单细胞悬液 400g 离心 7min，弃上清，1mL PBS 重悬计数。标记流式抗体：将流式抗体加入细胞悬液中，4℃，避光孵育 30min；抗体孵育完成后，400g ，离心 7min，弃上清，加入 1mL PBS 重悬，再 400g， 离心 7min，用 500μL PBS 重悬细胞后上机检测。

4.统计学处理 统计分析均使用 SPSS 19. 0 软件。计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.CD1d敲除加重 AngII灌注诱导的血压升高 与Saline组相比，Ang II灌注后野生小鼠血压明显升高(P<0.05)，而CD1d基因敲除进一步增加Ang II灌注引起的血压升高(P<0.05，图1)。

图1 CD1d基因敲除对 Ang II灌注引起血压升高的影响。注：与 Saline 组比较，*P<0.05；与 Ang II组比 较，#P<0.05

图2 CD1d敲除对 Ang II灌注诱导的血管厚度和炎症反应的影响。A： H&E染色检测血管壁厚度(×200)；B：定量qPCR检测血管组织中炎症因子IL-1β、IL-6 和 TNF-α mRNA的表达水平。注：与 Saline 组比较，*P<0.05；与 Ang II组比较，#P <0.05

图3 CD1d敲除对 AngII 诱导的血管纤维化的影响。A：Masson 染色检测血管组织中胶原沉积情况(×200；)B：及胶原面 积定量分析(右)(n=8)。注：与 Saline 组比较，*P<0.05；与 Ang II组比较，#P<0.05

2.CD1d敲除加重Ang II诱导的血管壁厚度及炎症反应 与 Saline组比较，Ang II 灌注明显增加血管壁厚度及炎症因子IL-1、IL-6和TNF-α mRNA的表达(P<0.05)，而CD1d基因的敲除进一步加重Ang II灌注引起的以上变化(图2)。

3.CD1d敲除加重Ang II诱导的血管壁中胶原的沉积 与Saline组相比，Ang II 灌注明显增加血管组织中胶原沉积，而CD1d敲除进一步加重Ang II 灌注引起的胶原沉积(P<0.05，图3)。

4.CD1d敲除增加Ang II 诱导的血管壁中巨噬细胞浸润 为了明确NKT是否调节血管组织中巨噬细胞的浸润，我们应用流式细胞技术检测了 CD45+F4/80+的巨噬细胞数量。结果表明与saline 组相比，Ang II 处理的 WT小鼠的血管中CD45+F4/80+的巨噬细胞明显增多，而CD1d敲除进一步增加这些细胞的数量(P<0.05，图4)。

讨 论

本实验发现Ang II灌注引起野生小鼠血压升高、血管壁的厚度增加、炎症因子mRNA的表达增加及血管中胶原纤维的沉积增多，而CD1d敲除加重了以上的变化，说明NKT细胞能够拮抗Ang II灌注引起的血压升高；进一步本实验还发现CD1d敲除进一步加重了Ang II灌注引起的巨噬细胞浸润。以上结果表明 NKT细胞通过调节巨噬细胞的浸润参与了对高血压的调节。

图4 CD1d敲除对 Ang II 诱导的巨噬细胞影响。A：流式细胞术分析血管组织中CD45+F4/80+炎性细胞比率；B：统计分 析(n=8)。注：与 Saline 组比较，*P<0.05；与 Ang II组比较，#P<0.05

高血压的发生过程涉及动脉血管结构和功能的异常改变，其主要病理改变包括血管壁增厚、平滑肌细胞增生/肥大、细胞外基质增多和炎症细胞聚集。本实验发现CD1d敲除导致NKT细胞不能活化，进一步加重了Ang II 灌注引起的血压升高，血管壁厚度增加及胶原的沉积，首次证明了NKT细胞参与了高血压的发生。NKT细胞激活后可产生Th1(如TNFα和IL-1β)和Th2型(如IL-4和IL-10)的细胞因子，这些细胞因子进一步影响先天性免疫和适应性免疫反应，包括NK细胞、抗原递呈细胞、CD4+和 CD8+T 细胞以及巨噬细胞的激活。鉴于巨噬细胞是机体内重要的吞噬和抗原提呈细胞，在维持促炎与抑炎反应中起着重要的作用[9]。在脉管系统和肾脏中，巨噬细胞衍生的ROS和炎症细胞因子可以导致内皮和上皮功能障碍，造成血管氧化应激和钠排泄的损伤，最终导致高血压等心血管疾病和肾脏疾病[10]。高血压的诱因如Ang II、DOCA-salt等可促进骨髓来源单核巨噬细胞增多，造成血管内皮的功能障碍[11]。基于此，我们进一步探讨了NKT细胞是否通过调节巨噬细胞从而参与对血压的调节。结果发现CD1d分子敲除明显加重了Ang II灌注诱导血管组织中CD45+的炎性细胞及巨噬细胞的增多，从而增加了血管的炎症反应，提示NKT细胞可以通过减少巨噬细胞的浸润而拮抗高血压的发生。

总之，本研究发现CD1d敲除加重Ang II灌注引起的血压升高、血管重塑包括血管壁厚度的增加和纤维化加重，并且加重了血管组织中巨噬细胞的浸润，说明NKT通过调节巨噬细胞参与高血压的发生。我们的结果为高血压的治疗提供一个新的靶点，但是NKT细胞是通过何种方式影响的巨噬细胞的聚集还有待我们的进一步研究。