探讨荧光免疫法检测乳腺癌组织中hMAN的可行性*

陈小萍 林群华

(1莆田学院基础医学部；2莆田市第一医学影像科 福建莆田 351100)

一个属于子宫球蛋白超家族的与乳腺癌组织特异相关的蛋白——人乳腺珠蛋白 (human mammaglobin，hMAM)是近年来专家学者研究乳腺癌的热点。乳腺珠蛋白在乳腺组织和乳腺癌组织中表达具有较高的灵敏度和特异性[1-2],有望成为乳腺癌的特异标志蛋白，可为乳腺癌的早期发现和诊断提供依据。国内外研究者用不同的方法从患者的血清[1]和组织[3]中都检测到了这种特异性蛋白。文章利用免疫荧光来检测乳腺癌组织中乳腺珠蛋白的表达情况，探讨免疫荧光法检测乳腺珠蛋白的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

(1)标本。该实验中的标本来自莆田市第一医院病理科，其中包括6例乳腺癌、6例正常乳腺(从乳腺纤维瘤旁取材)、6例乳腺纤维瘤。

(2)试剂。该实验中用的Mamamglobin B polyclonal(货号YT2632，购自厦门慧嘉生物生物科技有限公司)，二抗、染料等其他试剂均由上海锐赛生物技术有限公司提供。

1.2实验方法

(1) 固定、切片、脱蜡和水化。取新鲜组织经甲醛固定24h后用蜡块包埋，切成5μm的石蜡带，在45℃温水中展片，用干净的载玻片捞片，在70℃恒温箱内烤片2h后用二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min,再分别用无水乙醇、95%、70%、50%不同浓度的乙醇和纯水中各浸泡5min。

(2) 免疫荧光双标用0.01mol/LPBS 洗5min后滴加3%甲醇-H2O2溶液，静置15min后再用PBS洗3次，然后进行抗原修复(微波炉中高火力加热4min后再低火力加热20min，之后自然降至室温)。 再用PBS洗5min3次，滴加正常羊血清封闭液，室温放置60min，甩去多余液体，滴加稀释度为1∶200的Ⅰ抗100μL，4℃过夜，37℃复温45min，PBS再洗10min3次，滴加稀释度为1∶1000荧光兔Ⅱ抗(加0.05%的Trixton-100)100μL，室温避光静置2h。

(3)染色。用PBS洗10min3次，用DAPI避光染色5min，PBS洗5min3次后甘油封片(避光，滴加防淬灭剂)。

(4)显微镜观察。染色的切片用激光共聚焦显微镜(德国leica)断层扫描，图片叠加。蓝光的发射波长为461nm，红光的发射波长568nm，分辨率为553像素×463像素,计算机数据采集，以Image J图像分析软件对阳性信号荧光进行蛋白相对定量计算分析。

2实验结果

2.1 结果

免疫荧光发散光呈红色， DAPI 光发散光呈蓝色，DAPI与免疫荧光蛋白的发散波长有部分重叠。有荧光蛋白会发红色荧光为阳性，无荧光蛋白的不出现红色荧光为阴性(见图1)。乳腺癌组荧光信号强(见图1a)，在乳腺纤维瘤和乳腺正常组织中荧光信号弱(见图1b和1c)。

图1 不同乳腺组织中荧光蛋白图

2.2 统计学分析

每种研究对象取4个不同样本双聚焦显微镜下随机扫描5个层面，计算机计数其Area和IOD，取其平均面积和平均积光密度计算IOD/Area见表1，并以Image J 软件进行图象分析见图2。采用SPSS 19.0软件系统分析，等级采用t检验进行分析。

表1 各样本组织乳腺珠蛋白表达的统计资料

图2 乳腺珠蛋白相对表达量图

3讨论

目前报道过用于检测乳腺珠蛋白的方法有免疫组化法[4]，流式细胞法，ELISA[2]以及近年来发展的荧光定量PCR[5-6]。但这些检测方法大都存在较高的假阳性，准确性低，准确性和灵敏度较高的荧光定量PCR又不能直接体现该蛋白的表达，所以都存在一定的局限性。免疫荧光法既能直接直观监测目标蛋白的表达又能提高监测的准确性和特异性。免疫荧光法与免疫组化的原理大致相同，都是根据抗原与抗体的特异性结合后再染色，从染色结果来观察多肽、蛋白质的定位和相对定量分析。金晶晶[7]等认为免疫组化染色比免疫荧光染色操作步骤繁琐、耗时、易出现非特异染色，对结果判断造成一定的干扰。修敏[8]等认为免疫荧光法可通过免疫荧光分析软件更快捷简便地处理荧光图像，实现了对细胞荧光参数的相对定量分析，对肉眼难以准确判断的荧光图像具有很好的辅助分析。免疫荧光可以避免免疫组化的短处提高检测的特异性和灵敏度，而且免疫荧光的图像比免疫组化图像直观、美观。

段翠密[4]已报道过用免疫组化检测乳腺癌组织中乳腺珠蛋白的表达，该研究利用免疫荧光法检测乳腺珠蛋白在乳腺癌组织、乳腺纤维瘤组织和正常乳腺组织中的表达情况。结果是免疫荧光检测乳腺珠蛋白在乳腺癌组织、乳腺纤维瘤组织和乳腺正常组织均有表达 ，乳腺癌与正常组的表达差异性(p=0.0019，p<0.01 )，乳腺纤维瘤与乳腺正常组的表达的差异有统计学意义(p=0.071，p>0.05 )不具有统计学意义，结果与段翠密[4]和吕晓娟[9]的报道一致。

综上所述，免疫荧光法检测人乳腺珠蛋白克服了其他检测方法的局限性，从可行性、灵敏度和特异性方面说明可作为人乳腺珠蛋白的病理检测手段。