响应面法优化猪脑中神经节苷脂的硅胶柱层析纯化

龚鸣敬，李雪联，古明鲜，万书林，管天冰，何平，王建，戴传云，*

（1.重庆科技学院化学化工学院工业发酵微生物重庆市重点实验室，重庆401331；2.重庆寰瑞生物技术有限公司，重庆401332；3.重庆璧山国家农业科技园区，重庆402760）

神经节苷脂是一类含有唾液酸的酸性鞘氨醇脂，广泛分布于哺乳动物的脑组织细胞膜中，由于其具有促进脑神经元的成熟和受损神经的再生作用，因此对老年痴呆、心脑血管损伤及帕金森等神经性疾病的治疗具有较好的临床效应[1-2]。目前国内外对于神经节苷脂的分离与纯化研究，提出了诸多方法如：丙酮提取法[3]、氯仿-甲醇抽提法[4]、四氢呋喃提取法[5]和索氏提取法[6]等，然而上述提取方法得到的产物仍含有较多杂质，主要包括磷脂、胆固醇、硫酸脂等[7]，如何获取高纯度的神经节苷脂，对其科学研究发展与应用具有重大意义。

硅胶柱层析作为经典的分离纯化技术，具有选择性高、干扰因素少、可重复循环利用等特点，已被广泛用于食品、医药、农业等诸多领域[8-10]。本研究在传统索氏提取工艺基础上，利用响应面法试验设计原理，采用紫外-可见分光光度法定量分析，探讨神经节苷脂粗提物在硅胶柱层析的最佳纯化工艺，以提高产物中神经节苷脂的纯度，进而为其二次开发与利用提供条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜猪脑：市售；异戊醇、硫酸铜、丙酮、氯仿、甲醇、乙酸乙酯、间苯二酚、盐酸（分析纯）、硅胶（200目～300目）：国药集团化学试剂有限公司；唾液酸标准品、神经节苷酯标准品：美国Sigma；试验用水为二次纯化水。

间苯二酚-盐酸工作液：量取2%间苯二酚溶液10mL至100mL容量瓶中，加入含有0.25 mL、0.1 mol/L硫酸铜溶液的浓盐酸80 mL，加水定容摇匀。

1.2 仪器与设备

722型分光光度计：上海仪电科学仪器股份有限公司；RE-501旋转蒸发仪：郑州华特仪器设备有限公司；BCD-221EMK3A型冰箱：海尔电器；202A-4型电热恒温干燥箱：苏州市江东精密仪器有限公司；AE224型电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；SJIA-5FE冷冻干燥机：宁波双嘉仪器有限公司；耐腐蚀层析柱（25 mm×500 mm）：泰州市苏瑞玻璃仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 粗提物制备

取新鲜猪脑1 kg，匀浆搅拌后加入3 L氯仿-甲醇（体积比为1∶2），密封容器，搅拌过夜，次日离心（2 000 r/min、10 min），收集上清液。离心后的不溶物继续加入氯仿-甲醇（体积比为1∶2），搅拌过夜后，次日离心（2 000 r/min、10 min），合并上清液，冷冻干燥，即为神经节苷酯的粗提物[4]。

1.3.2 硅胶柱层析

称取定量的硅胶浸于洗脱剂内溶胀30 min，湿法装柱，洗脱液平衡15 min后上样，上样速度2.5 BV/h，吸附平衡后，洗脱剂以2.0 BV/h流速洗脱，收集洗脱液，真空旋转蒸发即得产物，通过下式计算得到产物的神经节苷酯回收率。

式中：m0为粗提物上样量，g；w0为粗提物中神经节苷酯含量，%；md为产物质量，g；wd为产品中神经节苷酯含量，%；R为回收率，%。

1.3.3 单因素试验

1.3.3.1 硅胶用量影响

分别配制浓度6%的样品溶液，取相同体积加入至装有 30、35、40、45、50 g 硅胶的层析柱中，经乙酸乙酯与甲醇（体积比为4∶1）的混合溶剂洗脱后，分别收集柱后洗脱液，测定各自神经节苷酯含量，计算其回收率。

1.3.3.2 上样浓度影响

分别配制浓度2%、4%、6%、8%、10%的样品溶液，取相同体积加入装有35 g硅胶的层析柱中，经乙酸乙酯与甲醇（体积比为4∶1）的混合溶剂洗脱后，分别收集柱后洗脱液，测定各自神经节苷酯含量，计算其回收率。

1.3.3.3 洗脱剂影响

洗脱剂对粗提物的洗脱效果，决定其柱后洗脱液中待测组分的回收率，因此采用薄层色谱法选择对粗提物中神经节苷脂具有良好分离效果的洗脱剂。吸取相同体积的样品溶液点样至硅胶板后，挥干溶剂，分别放入不同配比洗脱剂的烧杯内，待洗脱剂展开至板端1 cm处取出，挥干溶剂，显色，以标准品作对照，计算目标化合物在不同配比的洗脱剂中比移值。

1.3.4 响应面试验

在单因素试验基础上，利用Design-Expert 8.0.6.1软件的Box-Behnken试验设计原理[11-12]，以硅胶用量（A）、上样浓度（B）、洗脱剂配比（C）为响应因素，回收率（Y）为响应值，进行三因素三水平的响应面（response surface methodology，RSM）分析试验，确定猪脑组织中神经节苷酯粗提物的最佳纯化工艺。

1.3.5 定量分析方法

神经节苷脂中含唾液酸的寡糖链易与间二苯酚-盐酸溶液反应生成蓝紫色化合物，在可见光区具有最大吸收[13]，因此采用移液枪精密移取100 μg/mL唾液酸标准溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 于 5 mL 具塞试管中，随后加入间二苯酚-盐酸溶液2 mL，振摇后置于100℃沸水加热15 min，随后冷却加入4 mL异戊醇，离心取上层有机相，于620 nm最大吸收波长处测定各自吸光度，绘制唾液酸浓度（X）-吸光度（Y）的标准曲线，线性方程为：y=1.765 x-0.262（r=0.992 1），表明唾液酸浓度在10 μg/mL～50 μg/mL时，吸光度与其线性关系良好。

按校准曲线测定步骤，测定样品的吸光度A，根据校准曲线和吸光度计算唾液酸含量，进而计算样品溶液中神经节苷酯含量。

2 结果与讨论

2.1 粗提物含量

异戊醇作空白对照，精密称取神经节苷脂粗提物0.5 g，按照1.3.5所述测定方法于620 nm波长处测定吸光度，平行测定3次，代入校准曲线方程，计算粗提物中神经节苷脂的含量，结果见表1所示。

表1 粗取物中神经节苷脂含量Table 1 The content of gangliosides of crude extract

2.2 单因素试验分析

2.2.1 硅胶用量分析

层析柱内装载不同质量的硅胶对粗提物中神经节苷脂的回收率影响，见图1所示。

从图1可见，随着硅胶用量增多，产物中神经节苷脂的含量不断增大，但继续增大硅胶用量，回收率则逐渐下降，这归因于神经节苷脂在硅胶中残留量逐渐增大，因此选择30、35、40 g作为硅胶用量的响应因素水平。

图1 硅胶用量影响Fig.1 The effect of slica amount

2.2.2 上样浓度分析

上样浓度对粗提物中神经节苷脂的回收率影响，见图2所示。

图2 上样浓度的影响Fig.2 The effect of gangliosides concentration in crude extract

从图2可见，随着上样浓度增大，产物中神经节苷脂的含量不断下降，而回收率却不断增加。这归因于固定的硅胶用量下，增加上样浓度，目标化合物在硅胶的残留比逐渐降低，从而回收率提高，但由于其和部分杂质洗脱时间重叠，使得产物的含量逐渐下降，因此选择4%、6%、8%作为上样浓度的响应因素水平。

2.2.3 洗脱剂配比分析

表2为不同配比的洗脱剂洗脱目标化合物的比移值。

表2 不同体积的乙酸乙酯与甲醇在薄层色谱层析（thin-layer chromatography，TLC）中比移值（Rf）Table 2 The Rfvalue of ethyl acetate and methyl alcohol in different volume on TLC

从表2中可见，当洗脱剂为乙酸乙酯与甲醇（V∶V=4∶1），分离效果最佳，因此选择乙酸乙酯与甲醇体积比3∶1、4∶1、5∶1作为洗脱剂配比的响应因素水平。

2.3 响应面法分析

根据单因素试验结果，各响应因素水平见表3所示。表4为试验设计方案与响应结果。

表3 响应面分析因素及水平Table 3 Factors and levels of response surface design

表4 Box-Behnken设计方案及结果Table 4 Design and results of the Box-Behnken

对表4结果多元回归拟合，得到以回收率为目标的函数，关于各参数编码值的二次回归方程为：R=83.8-0.57A+2.24B+0.54C+0.007AB+0.45AC-0.075BC-2.81A2-1.24B2+0.36C2，对各参数进行方差分析，见表5所示。

从表5可知，该回归模型P＜0.01，表明其对粗提物中神经节苷脂的回收具有较好预测性，同时R2=0.943 7与R2Adj=0.871 4都接近于1，表示该模型可靠性较高，而变异系数＜1%，可知其它因素对响应值的影响较小，因此该回归方程可替代实际值对试验结果进行分析。一次项B对神经节苷脂的回收率影响显著，二次项A2、B2对试验结果影响显著，而交互项影响均不显著。从F值可知，影响神经节苷脂的回收率强弱顺序为：上样浓度＞硅胶用量＞洗脱剂配比。

表5 回归方程方差分析Table 5 Variance analysis for the fitted regression mode

2.4 响应面模型分析

图3反映不同两因素交互作用的响应面，其中曲面越大代表二者交互作用越大[14]，在中心点附近回收率愈高[15]。通过解二次多项回归拟合方程得到最优条件为：将质量浓度7.75%的粗提物样品溶液，以2.5 BV/h流速上样至装有34.89 g硅胶的层析柱后，采用乙酸乙酯与甲醇（体积比为4∶1）的混合溶剂以2.0 BV/h流速洗脱，预测产物中神经节苷脂的最大回收率为86.7%。

图3 不同两因素交互作用响应面Fig.3 Response surface of different two factors interaction

2.5 验证试验

为验证响应面法所得最佳纯化工艺的可实施性，将质量浓度为7.75%的样品溶液，以2.5 BV/h流速上样至装有34.89 g硅胶的层析柱后，采用乙酸乙酯与甲醇（体积比为4∶1）的混合溶剂，以2.0 BV/h流速洗脱，收集洗脱液，定量分析神经节苷脂的含量，结果见表6所示。

表6 纯化后产物的神经节苷脂含量Table 6 The content of gangliosides in product after purification

通过表6所得纯化后产物的神经节苷脂含量，计算得出神经节苷脂的回收率为86.9%，与预测值较为接近，表明采用响应面法得到的工艺参数准确可靠，对相关工业生产具有一定指导作用。提取物中神经节苷脂含量由纯化前12.23%提高至纯化后35.32%，为纯化前的2.89倍。

3 结论

本研究采用硅胶柱层析法纯化猪脑组织粗提物中神经节苷脂，利用响应面法优化得到最佳纯化工艺条件：将质量浓度为7.75%的样品溶液，以2.5 BV/h流速上样至装有34.89 g硅胶的层析柱后，采用乙酸乙酯与甲醇（体积比为4∶1）的混合溶剂以2.0 BV/h流速洗脱，洗脱产物中神经节苷脂回收率为86.9%，目标化合物含量为纯化前的2.89倍。该工艺操作简便、纯化效率较高，适合推广于相关工业应用。