中国荷斯坦牛乳房炎病原菌的分离鉴定与分析

唐 程，郭佳禾，王梦琦，倪 炜，毛永江

(扬州大学 动物科学与技术学院/扬州大学教育部农业与农产品安全国际合作实验室，江苏 扬州 225009)

乳房炎是奶牛的常见多发病，由于其防治困难，给奶牛养殖业造成了巨大的经济损失[1-2]。奶牛乳房炎病因复杂，微生物、物理、化学等致病因子都可以造成奶牛乳房感染[3]。病原微生物在乳房排空后产生负压，通过乳头管进入乳房，同时乳房内的牛奶为微生物提供天然培养基，造成乳房感染，是造成奶牛乳房炎的最主要因素[4]。目前，已经发现了150多种致病菌，常见的有23种，包括球菌、杆菌、支原体和真菌等[5]。中国荷斯坦牛作为产奶量最高、养殖数量最多、分布最广的奶牛品种，掌握其乳房炎的流行规律对奶牛乳房炎的预防和治疗具有重大意义[6]。

近几年，我国有许多学者对不同地区奶牛场乳房炎进行了流行病学调查及病原菌的调查研究。徐玉薇等[7]从中国福建、新疆、重庆3个不同规模奶牛场采集61份临床型乳房炎奶样，分离得到大肠杆菌(E.coli)、葡萄球菌(Staphylococcus)和链球菌(Streptococcus)3种主要病原菌；罗金印等[8]报道兰州奶牛乳房炎病原菌主要为无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)；韩淑芳等[9]对山西某奶牛场奶样分离鉴定发现，金黄色葡萄球菌为该奶牛场奶牛乳房炎主要致病菌。但很少有人对奶牛乳房炎病原菌的分布进行研究。为此，本试验从江苏某奶牛场采集2014—2016年共1 430份乳房炎奶样，进行主要病原菌的分离鉴定，并对不同病原菌在不同年龄、年份和季节的分布情况进行分析，旨在为预防奶牛乳房炎的发生和针对性治疗提供依据。

1 材料和方法

1.1 奶样采集

奶牛乳区红肿、热痛，乳汁有肉眼可见的变化，确诊为临床型乳房炎[10]。于2014—2016年采集江苏某规模化奶牛场2～8岁的中国荷斯坦奶牛1 430份临床乳房炎奶样。采样前先将乳头消毒，弃去前3把奶，收集30～40 mL奶样到无菌采样管中并标记相应信息，置于附有冰袋的采样箱内低温保存，送回实验室进行病原菌分离及鉴定。

1.2 病原菌分离培养

挑取均匀奶样，涂划在血平板上，倒置放入37 ℃培养箱培养24～48 h。从血平板上挑出形态不一致的单菌落，接种到增菌肉汤中，37 ℃培养箱培养24～48 h。当培养基的优势菌落为3个以上时视为奶样被污染。将增菌培养后的细菌进行载玻片、革兰染色、显微镜下观察细菌的形态和特征，将分离纯化的细菌进行鉴定，未分离纯化的细菌需重新进行培养分离纯化。

1.3 病原菌鉴定

使用细菌DNA提取试剂盒提取纯化后的细菌DNA。以提取的DNA为模板，用细菌16S rRNA通用引物进行扩增[11]，上游引物序列：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物序列：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，预期扩增片段大小为1 465 bp。将PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，并测序，所测得的序列在NCBI上进行BLAST比对，结合传统微生物鉴定法判定病原菌。

1.4 数据处理

采用SPSS非参数检验法，对1 430份乳房炎奶样在不同因素下各病原菌分布进行χ2检验。由于患乳房炎奶牛年龄数据的缺失，有年龄记录的乳房炎奶样只有1 046份。

2 结果与分析

2.1 乳房炎奶样病原菌分离鉴定结果

将1 430份乳房炎奶样进行细菌分离培养，提取菌株DNA并进行PCR扩增，扩增后产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。从图1可以看出，1 465 bp左右的扩增条带清晰，与预期大小一致。将所测得的序列在NCBI上进行BLAST比对，并结合传统微生物鉴定法，判定病原菌，结果见表1。由表1可知，采样奶牛场分离出金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、大肠杆菌、克雷伯氏菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、无乳链球菌，共7种致病菌。采样奶牛场由金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、大肠杆菌引起的单一感染共占1 354份(94.7%)，由凝固酶阴性葡萄球菌和大肠杆菌引起的混合感染占60份(4.2%)。

M.DL2000 DNA Marker;1—10.病原菌图1 分离病原菌PCR扩增结果

病原菌样品份数比例/%金黄色葡萄球菌443.1金黄色葡萄球菌、大肠杆菌20.1凝固酶阴性葡萄球菌77454.1凝固酶阴性葡萄球菌、大肠杆菌604.2大肠杆菌53637.5克雷伯氏菌20.1绿脓杆菌20.1其他链球菌20.1沙门氏菌40.3无乳链球菌40.3

2.2 不同年龄奶牛乳房炎病原菌鉴定结果

由于患乳房炎奶牛年龄数据的缺失，对检查出的主要致病菌按母牛年龄进行分析时只有1 046份乳房炎奶样(表2)。在所有检查出细菌中，凝固酶阴性葡萄球菌和大肠杆菌混合感染奶样48份，占检查细菌样的4.6%。金黄色葡萄球菌在不同年龄间分布差异显著(P<0.05)，金黄色葡萄球菌感染在3岁时最多，达到1.5%；凝固酶阴性葡萄球菌在不同年龄间分布差异极显著(P<0.01)，其主要分布在2岁(28.5%)和3岁(22.7%)；大肠杆菌在不同年龄间分布差异极显著(P<0.01)，其主要分布在3岁(26.1%)。在同一年龄间不同病原菌分布差异也达到极显著(P<0.01)，2岁患乳房炎奶牛共分离出428份(40.9%)主要致病菌，其中凝固酶阴性葡萄球菌分离出298份，占2岁分离主要致病菌的69.6%；3岁患乳房炎奶牛共分离出548份(52.4%)主要致病菌，其中凝固酶阴性葡萄球菌分离出237份和大肠杆菌分离出273份，分别占3岁分离主要致病菌的43.2%和49.8%。

表2 不同年龄奶牛乳房炎病原菌鉴定结果分析 份

注：括号内表示不同年龄奶牛分离病原菌占检出菌的比例。

2.3 不同年份奶牛乳房炎病原菌鉴定结果

共收集不同年份的乳房炎奶样1 430份，共检出1 414份主要致病菌，对检出的细菌进行分析，结果见表3。由表3可知，2014年、2015年及2016年分别分离出685份(47.9%)、710份(49.7%)、19份(1.3%)主要致病菌，分离的细菌菌株主要为金黄色葡萄球菌(3.1%)、凝固酶阴性葡萄球菌(54.1%)和大肠杆菌(37.5%)，在不同年份间分布差异极显著(P<0.01)；凝固酶阴性葡萄球菌和大肠杆菌混合感染在不同年份间分布无显著差异(P>0.05)。在2014年和2015年，同一年份不同病原菌分布差异极显著(P<0.01)；在2016年不同病原菌分布无显著差异(P>0.05)。

表3 不同年份奶牛乳房炎病原菌鉴定结果分析 份

注：括号内表示不同年份分离病原菌占检出菌的比例。

2.4 不同季节奶牛乳房炎病原菌鉴定结果

由表4可知，不同季节的细菌分布主要是金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌和大肠杆菌。金黄色葡萄球菌在不同季节间分布差异显著(P<0.05)；凝固酶阴性葡萄球菌在不同季节间分布差异极显著(P<0.01)，夏季分离出326份(22.8%)，冬季分离出189份(13.2%)；大肠杆菌在不同季节间分布差异极显著(P<0.01)，秋季分离最多，为207份(14.5%)；凝固酶阴性葡萄球菌和大肠杆菌混合感染在不同季节间分布无显著差异(P>0.05)。同一季节间不同病原菌分布差异极显著(P<0.01)。

表4 不同季节奶牛乳房炎病原菌鉴定结果分析 份

注：括号内表示不同季节分离病原菌占检出菌的比例。

3 结论与讨论

3.1 不同年龄奶牛乳房炎病原菌分布情况

由于患乳房炎奶牛年龄的缺失，本试验共收集了2岁、3岁、4岁及≥5岁不同年龄的奶牛乳房炎样本1 046份，通过传统微生物学方法和PCR检测方法结合进行细菌分离鉴定。根据细菌分离鉴定的结果可知，奶牛乳房炎以单一感染为主，从1 046份样品中分离得到的致病菌主要有金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、大肠杆菌，这与苏少虎等[12]对新疆地区奶牛乳房炎病原菌分离鉴定结果相似。其中，不同年龄间共分离到570份凝固酶阴性葡萄球菌(54.5%)，这与孙垚等[13]、Xu等[14]的分离结果相似，而高于林伟东等[15]27%的的分离结果；大肠杆菌分离到 399份(38.1%)；由凝固酶阴性葡萄球菌和大肠杆菌的混合感染48份(4.6%)。凝固酶阴性葡萄球菌已成为许多国家最常见的牛乳腺炎致病菌[16]，而牛场的卫生环境和饲养管理会影响凝固酶阴性葡萄球菌的感染率。造成奶牛乳房炎的病原菌主要分布在2岁和3岁。2岁奶牛乳房炎病原菌共分离出428份(40.9%)，其中分离出298份凝固酶阴性葡萄球菌，占2岁奶牛乳房炎主要致病菌总数的69.6%；3岁奶牛乳房炎病原菌分离出548份(52.4%)，其中分离出237份凝固酶阴性葡萄球菌、273份大肠杆菌，分别占3岁奶牛乳房炎主要致病菌总数的43.2%和49.8%。本研究结果表明，青年母牛凝固酶阴性葡萄球菌乳房炎患病率高于老年母牛，这与Tenhagen等[17]研究结果一致。

3.2 不同年份和季节奶牛场乳房炎病原菌分布情况

将收集的奶牛乳房炎样本按年份分析，在2014年共分离得到685份(47.9%)致病菌，其中主要致病菌为凝固酶阴性葡萄球菌(69.9%)和大肠杆菌(22.0%)；2015年总共分离致病菌710份(49.7%)，主要致病菌为凝固酶阴性葡萄球菌(40.6%)和大肠杆菌(53.0%)。这可能是因为2014年和2015年采样奶牛场奶牛主要是青年母牛，容易感染凝固酶阴性葡萄球菌，造成奶牛乳腺的感染。按季节对奶牛乳房炎病原菌的分布进行分析，发现金黄色葡萄球菌四季分布差异显著(P<0.05)，凝固酶阴性葡萄球菌四季的分布差异极显著(P<0.01)，主要分布在夏季(22.6%)和冬季(13.2%)。而Osteras等[18]、Koivula 等[19]研究表明，凝固酶阴性葡萄球菌主要流行于冬季和春季，这可能是因为气候和饲养条件不同造成的差异。不同季节间大肠杆菌分布差异极显著(P<0.01)，秋季分布最多，为207份(14.5%)；冬季分布最少，为81份(5.7%)；凝固酶阴性葡萄球菌和大肠杆菌混合感染四季分布无显著差异(P>0.05)。

综上，采样奶牛场乳房炎以单一感染为主，主要致病菌有凝固酶阴性葡萄球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。通过对不同年龄、年份和季节的病原菌分布情况分析发现，青年母牛感染率最高，凝固酶阴性葡萄球菌在夏季和冬季分布较多，大肠杆菌主要分布在秋季。因此，应该加强年轻母牛的饲养管理，加强奶牛场的环境卫生控制，优化挤奶方法和程序，做好季节防治工作。