利用SCID小鼠建立子宫内膜异位症模型的方法探讨

罗碧云, 李 莉, 江 玲

(1. 深圳市龙华区妇幼保健院, 深圳 518109;2. 广州中医药大学第一附属医院, 广州 510405)

子宫内膜异位症(endometriosis，EMT)是指具有生长功能的子宫内膜组织出现在子宫腔被覆内膜及宫体肌层以外的其他部位。EMT病变广泛、形态多样、极具侵袭性和复发性, 具有性激素依赖的特点[1]。然而其发病机制至今尚未明确, 因此, EMT动物模型的建立对其发病机制的研究、治疗方案的改善等探索的意义重大。1984年，Jones等[2]成功用自体移植法建立SD大鼠内异症模型。有研究[3]表明对比手术逆流法与种植法的成模率，逆流组70%，种植组90%。若作为人子宫内膜组织物移植受体动物，需排除自身免疫排斥反应，尽可能大地还原基础模型并保证存活率，而大鼠模型无法达到这一要求。SCID小鼠是基因突变的CB-17近交系小鼠，为先天性T、B淋巴细胞联合免疫缺陷动物[4], 可以克服异种间的免疫排斥反应, 移植后的组织可保持原有的组织形态及生化特性, 且移植后的组织存活率较裸小鼠高, 易于发生侵袭和转移, 故国外已将SCID小鼠作为人子宫内膜组织的常用受体动物。Rossi等[5]用腹腔注射法成功建立了BALB/c小鼠的EMT模型。本实验基于SCID小鼠EMT模型观察周期短，可极大程度保持原有移植物组织形态及生化表现，拟探究腹腔注射法建立SCID小鼠子宫内膜异位症模型的拟合程度及可操作性。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级56～62日龄雌性SCID小鼠18只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2012-0001]，体质量为17～25 g，饲养于 SPF设施[SYXK(粤)2013-0092], 24 ℃恒温, 12 h光照 12 h黑暗交替，自由摄取食物和水。

1.2 主要实验器材及试剂

无菌操作台、无菌手术器械、无菌PBS液, 购自南京森贝伽生物科技有限公司; 含人子宫内膜碎片的PBS液, 兽用苯甲酸雌二醇注射液, 购自南昌前景兽药有限公司; 无菌DMEM培养液(含100U/mL青霉素, 100 U/mL链霉素), 购自广州瑞舒生物科技公司。

1.3 模型制备

充分知情同意下，取在申报单位附属医院腹腔镜下确诊为I～II期EMT患者的病理确诊为分泌期子宫内膜，将新鲜的标本置入含无菌DMEM培养液的培养皿中, 并用0.1 mol/L无菌PBS液漂洗3次，以洗去血块和粘液，用无菌眼科剪刀将内膜标本剪成0.5～1 mm3的内膜碎片, 平均分装至1 mL PBS溶液的针管内，备用。内膜种植在取材后半小时内完成。将小鼠固定在无菌操作台上，腹部酒精常规消毒后用16号针头于小鼠下腹正中行腹腔穿刺，注入含子宫内膜碎片的PBS液0.2 mL, 含内膜碎片8～10块, 压迫穿刺点, 观察无出血。种植第2日小鼠腿部肌注给予30 mg/kg体质量的苯甲酸雌二醇，以利于子宫内膜生长种植。

2 结果

2.1 大体观察

常规饲养4周后，肉眼观察见小鼠精神状态变差，或体质量下降、或为消瘦态或生长缓慢，毛发稀疏(图1)，反应较迟钝，活动减少，但食欲良好，大便小便正常。开腹探查后，肉眼观察均可见不典型内异症病灶生成，或为灰褐色内异症结节，或形成内异囊肿(图2)。

2.2 病理学观察

本次实验造模数为18只，成活率100%。取病灶行病理检测，均未见典型的子宫内膜腺体，部分可见炎性细胞渗出和(或)红细胞或含铁血黄素沉积(图3A、B)。部分仅见炎性细胞渗出，未形成炎性囊肿或脓肿可能(图3C、D)。

3 讨论

图1 模型小鼠外观观察

图2 模型小鼠剖检观察

图3 造模小鼠子宫内膜病理学观察

典型的子宫内膜异位病灶病理具备“三要素”[6]： ①囊壁内衬上形态类似子宫内膜腺上皮;②上皮下有子宫内膜样间质; ③伴有新鲜或陈旧性出血，可见红细胞、含铁血黄素沉积或吞噬含铁血黄素的巨噬细胞。非典型的组织形态表现为“三要素”有缺项： 内衬上皮脱落，或仅见少数不完整的可疑内膜间质; 出血等继发改变现象不明显或只能见到含铁血黄素物质沉积，但缺乏特异性。

EMT的发病机制尚未明确, 其动物模型的建立在科研方面意义深远[7]。Bergqvist等[8]将EMT患者在位及异位内膜组织同时种植到同只裸小鼠(n=24)腹部皮下, 成模率为34.4%。Fortin等[9]将人子宫内膜与编码绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒孵育后种植到小鼠皮下, 其腺病毒仅可转染15%～ 40%的内膜细胞。Novella-Maestre等[10]、Banu等[11]均采用腹腔注射法将子宫内膜细胞注射到裸小鼠腹腔(n=7、n=16)，EMT成模率100%。但因其造模数少，仅可供参考, 无法以此衡量造模之优劣。单婧等[12]认为小鼠模型因其体型小、操作性低、死亡率高等，导致成模率低。崔阳阳等[13]认为免疫缺陷小鼠模型虽不存在排斥反应，但在不同程度上影响了腹腔液中的生长因子及细胞因子。Weed等[14]也提出EMT和机体免疫相关，至今已有不少证据支持免疫[15]及炎症因素[16]在EMT发病机制中的重要作用。有学者[17]认为利用人子宫内膜进行移植存在伦理问题且免疫缺陷小鼠免疫功能的缺乏限制了EMT免疫机制的研究。本实验采用腹腔注射法建立SCID小鼠EMT模型结果不理想，因其易形成炎性囊肿，影响盆腔微环境，且异体移植组织较小，实验过程复杂，手术操作困难。

综上所述，采用腹腔注射法建立SCID小鼠EMT模型，其拟合程度、可操作性较低，不宜作为EMT动物模型的首选。