中药复方开心散调控神经营养因子抗抑郁物质基础与作用机制研究＊

曹 程，肖钧元，刘梦秋，黄人杰，戚明珠，朱梓强，王之康，陈铚淳，郑嘉妮，刘 培，段金廒，朱 悦

（南京中医药大学药学院，江苏省方剂研究重点实验室/江苏省方剂高技术研究重点实验室/中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心/江苏省中药资源产业化过程协同创新中心 南京 210029）

抑郁症，是一项以长期心情压抑、情绪低落为主要特征的危害人类健康的情志疾病。若病人有连续出现2周以上的心境低落、失眠或嗜睡等睡眠障碍、不思饮食或暴饮暴食等饮食障碍等症状，且无法通过自我调节缓解，即可诊断为抑郁症。抑郁症患者极易有轻生念头，是自杀的高危人群，故而备受人们重视，抑郁症的诊疗已成为精神病学研究的热点。抑郁症的发病机制极为复杂，已提出了单胺类神经递质调控紊乱，神经营养因子缺失所致神经可塑性降低、下丘脑-垂体-肾上腺压力系统调控紊乱、中枢神经炎症等多种假说。但是，目前临床最常用的抗抑郁药物均为基于单胺类神经递质调控紊乱假说所开发的神经递质再摄取抑制剂，如丙咪嗪、氟西汀、文拉法辛等。但是，仍有40%的病人对这些药物无效。这不仅证明了神经递质并非抗抑郁药物的唯一靶点，也对开发能够作用于多环节的抗抑郁药物提出了要求。

图1 开心散效用部位分离流程图

开心散始载于唐代著名医药学家孙思邈所著《备急千金要方》,全方由人参、远志、石菖蒲、茯苓四味药组成，用治“好忘”与“主心气不定，五脏不足，忧愁不乐，忽忽遗忘，朝瘥暮极，狂眩”[1]，与抑郁症和阿尔茨海默症的症状极为类似。在长期的应用过程中，根据辨证论治的临证需要，形成了不同配伍比例[2,3]。现代研究也已证实，开心散是用治临床轻度与中度抑郁症的有效方剂[4]。前期研究发现，开心散可通过提升脑内神经递质与神经营养因子的表达缓解动物的抑郁样症状，并在细胞水平发现，开心散可以促进星型胶质细胞合成与分泌神经营养因子，其中，人参、远志、石菖蒲与茯苓配伍比例为3∶2∶2∶3的配伍比例具有最强的抗抑郁与促进神经营养因子表达的效果[5-8]。但是，具体起效的作用成分尚不明了。因此，我们对已筛选出的开心散配伍比例，采用不同比例的乙醇洗脱，制备了大孔树脂乙醇系列洗脱部位，并采用悬尾和强迫游泳动物模型评价其抗抑郁效果，检验其对受试动物海马组织中神经生长因子与脑源性神经营养因子表达的影响。同时利用大鼠星型胶质瘤C6细胞系和大鼠肾上腺嗜铬瘤PC12细胞系，评价不同乙醇洗脱部位对C6细胞系中NGF与BDNF表达的影响和对PC12细胞分化的影响，并进行成分鉴定。从而揭示开心散调控神经营养因子的作用机制与相关物质基础。

1 材料

1.1 动物

ICR小鼠（全雄，20-22 g），购自上海西普尔-必凯实验室动物有限公司。许可证号SCXK（沪）2013-0016。动物饲养于SPF级环境中，自由饮食进水。

1.2 药物

人参（Panax ginseng C.A.Mey，批号170111）、远志（Polygala tenuifolia Willd，批号 170112）、石菖蒲（Acorus tatarinowii Schott，批号 170113、茯苓（Poria cocos(Schw.)Wolf，批号140825）、购自苏州天灵中药饮片有限公司，经南京中医药大学段金廒教授鉴定为合格药材。

1.3 试剂

小鼠 NGF ELISA 试剂盒（JEB-12458），BDNF ELISA试剂盒（JEB-12339LF-EK50009）购自南京金益柏生物科技有限公司。TRIzol RNA提取试剂盒（15596-026）购自美国Invitrogen公司。RT-PCR反转录试剂盒（EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix，AE311）与SYBR荧光定量PCR试剂（TransStart Top Green Mix qPCR SuperMix（+Dye II），AQ132）购自北京全式金（TransGen）生物公司。细胞培养试剂均购自美国Thermal Fisher公司。其余所有试剂除特殊标明外，均购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.4 仪器

动物行为测试系统，购自上海吉量软件科技有限公司。qPCR仪（7500 Real Time PCR System），购自Applied Biosystem公司。倒置荧光显微镜和拍照系统（Axio Vert A1），购自德国ZEISS公司。

2 方法

2.1 开心散大孔树脂乙醇洗脱部位的制备

分别取用人参、远志、石菖蒲、茯苓药材，按3∶2∶2∶3的比例组合成100 g，加入1000 mL水，回流提取2 h，滤过。再加入800 mL水，继续回流提取2 h，滤过。合并两次煎液，减压浓缩制得1 g/mL的水提浓缩液。缓慢加入乙醇进行醇沉，使醇浓度达70%。离心取上清液，滤过沉淀。将上清液中乙醇回收，提取物上D101大孔吸附树脂，依次用水，10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇进行梯度洗脱，获得相应洗脱部位。冷冻干燥，得干粉。按照图1样品制备流程图制备各组分样品。

2.2 抑郁样行为学测试

抑郁样行为测试分为悬尾实验与强迫游泳实验。悬尾实验的具体步骤为：将小鼠头部向下，悬挂在距离台面高30 cm的挂钩上。并使小鼠不能爬上挂钩。悬尾时间共计6 min，待小鼠悬尾2 min后，统计后4 min内的不动时间（小鼠停止挣扎，静止悬挂）。强迫游泳实验的具体步骤为：将小鼠放入高20 cm、直径14 cm的圆柱型玻璃缸中，每缸1只，缸中水深10 cm，水温25℃。强迫游泳时间共计6 min，待小鼠游泳2 min后，统计后4 min内的不动时间（小鼠在水中停止挣扎，或呈漂浮状态时间）。

表1 引物序列

2.3 ELISA法测定海马组织神经营养因子含量

行为学测试结束后，处死小鼠，解剖获得海马组织，液氮迅速冷冻，粉碎。称取相应重量组织，加入10倍体积的组织裂解液（10 mM HEPES,pH 7.5,1 M NaCl,1 mM EDTA,1 mM EGTA,0.5%Triton X-100,5 mM benzamidine HCl,10 mM aprotinin,10 mM leupeptin），利用NGF与BDNF ELISA试剂盒，按试剂盒所列操作步骤，测定NGF与BDNF的含量。试剂盒检测范围为7.8-500 pg/mL。

2.4 细胞培养

大鼠胶质瘤细胞系（C6）：培养基组成为H-DMEM，10%胎牛血清（FBS），1%青霉素/链霉素（P/S）。每48h换液一次，待细胞密度为70%进行传代。传代三次后的稳定生长状态细胞用于种板和给药实验。

大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系（PC12）：培养基组成为H-DMEM，6%胎牛血清(FBS)，6%马血清（HS），1%青霉素/链霉素（P/S）。每48 h换液一次，待细胞密度为70%进行传代。传代三次后的稳定生长状态细胞用于种板和药物实验。给药前3小时，培养基需要将培养换为分化培养基。培养基组成为：H-DMEM，1%胎牛血清(FBS)，1%马血清（HS），1%青霉素/链霉素（P/S）。

2.5 实时定量荧光PCR法测定神经营养因子转录水平表达

取加样培养后的细胞样品，用PBS清洗后，加入TRIzol试剂，按TRIzol RNA提取试剂盒所列步骤提取RNA。RNA纯度标准控制为A260nm/A280nm比值为1.8-2.0之间。所提取RNA于-80°C保存。取1 μg RNA，依据Transgen逆转录试剂盒的说明，进行逆转录操作制得cDNA。然后依据SYBR荧光实时定量试剂盒操作步骤，利用荧光实时定量PCR仪测定神经营养因子的基因转录水平表达。扩增条件为：维持阶段，50℃，2 min；94℃，10 min；循环阶段，94℃，15 sec；60℃，1 min；共40个循环。所用引物序列见表1。基因的表达量用2-△△Ct计算，设置GAPDH为内参基因。以正常组对照组样本为对照样本，设为100%，计算其余各组的基因表达差异。

2.6 大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞分化程度评价

PC12细胞给药48 h后，抽去培养基，用PBS清洗三遍，采用4%多聚甲醛（PFA）固定，固定24 h后，显微镜下拍照。以树突长度大于胞体两倍的细胞作为分化的细胞。随机选取十个拍照视野，统计分化细胞个数，计算分化率。分化率=分化细胞数目/细胞总数。

2.7 统计学处理与数据表示

采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）分析，结果以s表示，以P＜0.05为有差异，以P＜0.01有极显著差异。

3 结果

3.1 开心散大孔树脂乙醇洗脱组分抗抑郁效用评价。

基于之前研究结果，我们选取药材，按人参：远志：石菖蒲：茯苓为3∶2∶2∶3的配伍比例制备开心散，然后利用大孔树脂制备不同浓度乙醇洗脱组分。将不同洗脱组分按低剂量（3 g/kg，以生药量计算）与高剂量（10 g/kg，以生药量计算）给小鼠灌胃7天后，进行悬尾与强迫游泳测试。统计行为学测试结果发现，各洗脱组分给药组与空白组相比，均能显著缩短动物不动时间（P＜0.05）显示出明显的抗抑郁作用（结果见表2）。各组分中，开心散50%、70%与90%乙醇洗脱组分效用最强，趋势与阳性药氟西汀作用相当。

3.2 开心散大孔树脂乙醇洗脱组分对小鼠海马组织中神经营养因子表达的影响

3.1中行为学测试结束后，分离各组小鼠的海马组织，利用酶联免疫吸附实验（ELISA）测定海马中神经生长因子（nerve growth factor，NGF）与脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）的含量。发现，开心散50%、70%与90%乙醇洗脱组分给药后，受试动物海马中NGF与BDNF含量，与空白组小鼠相比，均有显著提升（与空白组相比，P＜0.05），作用趋势与行为学结果趋势一致，其中以高剂量的70%乙醇洗脱组分的作用趋势最强（结果见图2）。

表2 开心散大孔树脂乙醇洗脱部位抗抑郁行为学评价（ s,n=10）

表2 开心散大孔树脂乙醇洗脱部位抗抑郁行为学评价（ s,n=10）

*与空白组比较，P＜0.05；**与空白组组比较，P＜0.01。

强迫游泳不动时间/S 75.01±3.60 35.12±7.98**56.26±16.33*51.01±11.13*49.51±10.17*48.76±6.47*60.01±8.58*55.51±7.04*51.01±6.35*52.51±5.27*51.76±11.31*41.26±10.02**48.76±5.51*44.26±6.01**组别正常组氟西汀组0%-L 0%-H 10%-L 10%-H 30%-L 30%-H 50%-L 50%-H 70%-L 70%-H 90%-L 90%-H剂量-7.2 mg·kg-1 3 g·kg-1 10 g·kg-1 3 g·kg-1 10 g·kg-1 3 g·kg-1 10 g·kg-1 3 g·kg-1 10 g·kg-1 3 g·kg-1 10 g·kg-1 3 g·kg-1 10 g·kg-1悬尾不动时间/S 68.17±5.09 34.09±4.11**46.36±3.12*47.04±6.14*43.63±4.10*42.95±3.27*44.99±4.19*44.31±7.92*39.54±8.13*33.40±3.12**49.08±2.48*32.72±3.22**40.90±9.01*35.45±2.85**

3.4 开心散大孔树脂乙醇洗脱组分对大鼠胶质瘤C6细胞中NGF与BDNF表达的影响

为了进一步验证开心散各乙醇洗脱组份促进神经营养因子表达的作用，我们采用大鼠胶质瘤C6细胞进行研究。各洗脱组分按高、中、低三个剂量（1-3μg·mL-1）加至C6细胞系培养48 h后，采用qPCR法检测NGF、BDNF的mRNA表达情况。结果表明，与空白组相比，开心散50%、70%与90%乙醇洗脱组分均显著增强神经营养因子NGF与BDNF的作用趋势（与空白组相比，P＜0.05），作用趋势与阳性药Forskolin相当，而0%、10%与30%乙醇洗脱组分未见显著作用。各组分中，以开心散70%乙醇洗脱组分高剂量（3 mg/mL）促NGF与BDNF mRNA表达作用最强（结果见图3）。

依据上述实验结果，我们选取开心散70%乙醇洗脱部位的高浓度（10 mg/mL），加以cAMP信号通路阻断剂H89与ERK信号通路的阻断剂TPA，测定NGF与BDNF mRNA表达，探索70%乙醇洗脱部位促进神经营养因子表达的作用信号通路。结果显示，开心散70%乙醇洗脱部位上调NGF和BDNF表达的趋势均被H89减弱，无法被U0126减弱（结果见图4），所以开心散促进NGF与BDNF表达的作用可能是通过激活cAMP信号通路实现。

3.5 开心散大孔树脂乙醇洗脱组分促大鼠胶质瘤C6细胞中NGF与BDNF表达的效用成分研究。

利用高效液相串联飞行质谱（HPLC-QTOF-MS/MS），我们鉴定发现，开心散70%乙醇洗脱部位的主要成分是人参皂苷，其中含有人参皂苷Rb1、Rg1和Re。因此我们计算了该部位中三种人参皂苷的含量，选择合适的高中低剂量范围，考察了三种人参皂苷作用于C6细胞系48 h后，神经营养因子NGF与BDNF转录水平表达。结果如图5所示，人参皂苷Rg1（50 mM）上调NGF mRNA表达的效用最强，人参皂苷Rb1（50 mM）上调BDNF mRNA表达的效用最强（P＜0.01），均具有量效关系。因此，人参皂苷是开心散中促进神经营养因子表达的关键成分。

3.6 开心散大孔树脂乙醇洗脱组分对大鼠肾上腺嗜铬瘤PC12细胞分化作用的影响。

图2 开心散大孔树脂乙醇洗脱组分对小鼠海马区神经营养因子表达的影响

图3 开心散大孔树脂乙醇洗脱组分对C6细胞中神经营养因子表达的影响

图4 开心散大孔树70%乙醇洗脱组分促C6细胞中神经营养因子表达的信号通路研究

图5 人参皂苷对C6细胞中神经营养因子表达影响

图6 开心散大孔树脂乙醇洗脱组分对PC12细胞分化能力的影响

除了促神经营养因子表达的作用，我们还采用大鼠肾上腺嗜铬瘤PC12细胞，考察了各洗脱组分拟神经营养因子作用。如图7所示，高浓度NGF（50 ng/mL）会促进PC12细胞分化，表现出树突显著增长的现象。其促分化程度与NGF的浓度呈现出剂量依赖关系。将各洗脱组分加至PC12细胞培养48小时后，分化细胞数与空白组相比，没有发现显著的变化，表明各洗脱组分显著的促PC12细胞分化的能力。但各组分与低浓度的NGF（0.005 ng/mL）合并给药PC12细胞48小时后，开心散0%、10%与30%乙醇洗脱组分可显著增益低浓度NGF促进PC12细胞树突增长，促进细胞分化（结果见图6），而50%、70%与90%乙醇洗脱组分未见显著作用。提示开心散增益低浓度NGF促进PC12细胞分化的成分与促进NGF表达的成分有所不同。

4 讨论

神经营养因子是一类维持神经元生长与存活所必需的蛋白质，在神经元的生存、分化发育、突触形成、神经可塑方面起着重要作用神经营养因子家族主要有神经生长因子（NGF），脑源性神经营养因子（BDNF），神经营养因子3（NT-3），神经营养因子4/5（NT-4/5）等。中枢神经中神经营养因子由神经元与星型胶质细胞共同分泌产生，在神经末梢以受体介导式入胞的方式进入神经末梢，再经逆向轴浆运输抵达胞体，促进胞体合成有关的蛋白质，发挥其支持神经元生长、发育和功能完整性的作用。相关的受体主要有低亲和力受体p75与Trk受体。cAMP通路是促进NGF与BDNF表达的主要作用通路。临床研究表明，抑郁症患者血清中神经营养因子NGF与BDNF均有显著下降趋势，尤其BDNF已成为公认的抑郁症诊断的生物标志物[9-11]。动物研究证明，抑郁症动物脑中NGF、BDNF的含量表达下降，尤其是在与抑郁症发病最密切相关的海马与前额皮质部位[12]。离体细胞实验证明，这些部位神经营养因子的缺乏，将直接导致神经元损伤，死亡，影响正常的神经生长过程[13]。但是，由于神经营养因子是一类蛋白质，无论是口服或是脑区直接注射都无法在临床应用，所以开发药物促使神经营养因子分泌更具有实际意义。

开心散是临床与动物实验均已证实的抗抑郁有效方剂，《备急千金要方》中最初的开心散用法记载是“治下筛，饮服方寸匕”，是将四位药材粉碎混合服用，但在后世的使用中则多以汤剂应用，其配伍比例随着辨证论治的不同结果进行调整。中医药传统理论认为，湿浊中阻，心气虚损是导致抑郁症的重要病机。若证情偏实，则加大菖蒲与茯苓的用量，逐痰化湿；若证情偏虚，则加大人参与远志的用量，补益心气[14]。我们曾在动物模型上比较了古代医籍中记录的开心散不同配伍比例的抗抑郁效果，最终发现人参、远志、石菖蒲与茯苓配伍比例为3∶2∶2∶3的配伍比例具有最强的抗抑郁效用，能显著提升前额皮质与海马区NGF与BDNF的表达[6]。

分析开心散中药味所含的具有神经活性的物质，人参主要为人参皂苷类成分，远志主要为远志皂苷、远志口山酮与寡糖酯类成分，石菖蒲主要为细辛醚类成分，茯苓主要为茯苓酸等三萜酸类成分[15]。这些成分中，除了细辛醚类成分，均很能通过血脑屏障，难以直接作用于神经元。而中枢神经系统中神经营养因子的重要来源星型胶质细胞也是血脑屏障的重要组成部分，因此，我们认为开心散成分极有可能通过作用于星型胶质细胞来调控神经营养因子的表达，因此我们采用了大鼠胶质瘤C6细胞系来筛选相关有效成分。

将大孔树脂乙醇洗脱制备的开心散组分作用于C6细胞系后发现，70%乙醇洗脱的组分具有最强的促进神经营养因子表达的作用，经过成分鉴定，发现该组分主要由人参皂苷组成。我们将鉴定出的人参皂苷单体再次作用于C6细胞系，也发现其能够促进神经营养因子表达。因此人参皂苷是开心散该效用的重要作用成分，这也与相关人参皂苷单体成分抗抑郁的报道相符[16]。

前已述及，由于抑郁症病人脑内神经生长因子表达降低，无法维持神经元的正常生长，神经传递阻滞，从而产生了情志障碍。因此，我们还用最常用来评价促神经元分化能力的PC12细胞来考察开心散组分是否具有拟神经生长因子的作用。研究发现，开心散的各洗脱组分均无法直接促进PC12细胞分化，但是开心散10%乙醇洗脱组分与低浓度的NGF联合，却可以显著促进PC12细胞分化，作用与高浓度的NGF相当，表现出显著的增益低浓度神经生长因子的效用，而70%乙醇洗脱组分却没有表现出该效用。这些现象充分证明了开心散可通过促进神经营养因子表达与增益神经营养因子作用等环节起到调控神经营养因子系统，改善神经生长状态，来达到抗抑郁的效用。

可是，虽然开心散10%乙醇洗脱部位在神经元分化上有最强的作用趋势，但是其中的成分却未见于开心散已有药材成份报道，因此其物质基础暂时未能阐明，我们将在后续研究中进一步探索功效物质基础，并进行作用机制的深入研究。