当归芍药散活性成分治疗阿尔兹海默病作用机制的生物网络分析＊

宋祯彦，陈易璇，余婧萍，成绍武

（湖南中医药大学中西医结合心脑疾病防治湖南省重点实验室 长沙 410208）

1 前言

阿尔兹海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一种与年龄相关的神经退行性疾病。据报道平均每33秒就有一名新的AD患者产生，截止到2016年，全球有超过7000万人患有AD[1]。AD主要以存在不溶性β淀粉样斑块,神经原纤维缠结和神经元的损失为病理特征[2]。临床上AD表现为渐进性记忆丧失和认知能力的逐渐衰退。目前临床治疗虽然部分有效地减少了适度的症状，但没有任何药物可以阻止AD病程的发展[3]。考虑到AD是一个多因素、多途径引发的疾病，单一疗法作用单一靶点的治疗原则是不合适的，而中医的整体观在多组分多靶点治疗方面的经验为防治AD提供了光明的前景。

当归芍药散（Danggui Shaoyao San，DSS）出自《金匮要略》，由当归、芍药、川芎、白术、泽泻、茯苓六味中药所组成，具有养血调肝，健脾利湿，活血化瘀，化痰通络的功效。日本学者首先发现DSS能改善AD患者的运动障碍和认知功能下降[4]，随后大量研究证明DSS对AD确实有一定的治疗作用，如能明显改善Aβ诱导的海马CAl区LTP抑制[5]，提高海马齿状回胆碱能阳性神经纤维的数量和海马突触数量，改善突触后终末结构[6]，抑制海马区Aβ的沉积和神经炎症[7]，同时还能改善多种痴呆模型动物的学习记忆能力[6,8]等。但对于DSS治疗AD的研究都局限于某一个生物学功能，很难从系统层面上深入探索其作用机制。

网络药理学作为一个新兴的药理学研究领域，强调了“多成分，多靶点治疗网络”的概念，突出了中医整体的思想，它为研究中医药治疗AD的多靶点作用机制提供了新的思路。本文利用网络药理学方法分析了DSS防治AD的作用机制，首先从TCMSP数据库筛选获得中药方剂DSS的有效成分并对有效成分进行靶点预测，其次利用网络药理学分析化合物-靶点的相互作用，建立了化合物-靶点网络和化合物-靶点-AD网络，最后，运用生物信息学分析方法阐明了DSS防治AD的多靶点多途径作用机制（如图1）。

2 材料与方法

2.1 当归芍药散中活性化合物数据库建立

本文利用TCMSP数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/）收集和下载当归芍药散中所有化合物，进行药物分子药动学性质（ADME，即吸收、分布、代谢、排泄）的预测和分析，筛选获得符合条件的活性化合物：第一，当归芍药散作为中药方剂，汤剂以口服作为主要服药形式，因此设置了口服生物利用度（OB）≥30%为筛选条件之一[9]；第二，中枢神经系统的靶向药物必须通过血脑屏障才能产生药效作用，因此设置了血脑屏障渗透性（BBB）≥-0.3为筛选参数[10]；第三，类药性（DL）是与生物活性同等重要的性质，对于口服药物来说，达到作用靶点需要经过体内较多的生物学过程，具有较高的类药性的化合物才能被安全送达靶器官、靶细胞发挥其生物学效应，因此设定了DL≥0.1为筛选条件[11]。

2.2 靶点预测

为了获得DSS活性化合物的靶点，本文采用文献挖掘技术、数据库检索和化学计量学分析等方法整合药物活性化合物的靶点信息。首先，在TCMSP中搜索药物活性化合物信息，初步得到活性化合物的靶点信息；第二，根据活性化合物配体之间的化学相似性，在SEA（http://sea.bkslab.org）和 the Binding Database（http://www.bindingdb.org）中查找，补充靶点。第三，利用UniProt（http://www.uniprot.org/）将靶点名称进行标准化命名，汇总活性化合物的靶点数据。

2.3 网络关系图建立

为直观展示药物、化合物、靶点、疾病之间的相互关系，以及药物作用的靶点定位，本文利用Cyto⁃scape_v3.4.0[12]建立网络关系图。可视化网络由节点（node）和边（edge）组成，节点代表分子（药物、靶点和化合物），边则表示节点之间的联系（即药物、化合物和靶点间的交互关系）。

2.3.1 药物-化合物-靶点网络

图1 DSS治疗AD的网络药理学分析工作流程图

当归芍药散由当归、芍药、川芎、白术、泽泻、茯苓六味中药所组成，在TCMSP中筛选得到每种药物对应的活性化合物，并通过靶点预测获得各活性化合物对应的靶基因，利用CytoScape_v3.4.0建立“药物-化合物-靶点”（Herb-Compound-Target，H-C-T）网络。

2.3.2 药物-靶点-AD网络

DisGeNET数据库（http://www.disgenet.org/）整合了大量与人类疾病相关的基因和蛋白靶点数据，最新版本共包含561119个疾病与基因的联系和135588种疾病与表型的联系[13]。为了阐明当归芍药散在AD中的作用，本文在DisGeNET5.0中搜索与AD相关的靶点，并筛选出当归芍药散作用靶点与AD相关性基因的重合部分，利用CytoScape_v3.4.0建立AD相关性“化合物-靶点-AD”（Compound-Target-AD，C-T-AD）网络。

2.3.3 靶点-器官定位网络

BioGPS是一个查询和搜索目的基因注释信息的数据库，通过微阵列分析，可以提供细胞或组织中的基因表达丰度数据[14]。本文利用GeneAtlas U133A,gcrma（http://biogps.org）数据集建立靶点-器官定位网络。首先，获得每个靶基因在人体84个器官组织中的mRNA表达水平，并计算各靶基因mRNA在器官中平均表达水平；然后，筛选出mRNA表达水平高于平均水平的器官或组织，作为该靶基因所定位器官或组织；最后，以心、肝、肺、肾、全脑、全血为主要定位器官，利用Cyto⁃scape_v3.4.0构建特异性靶点-器官定位网络。

2.4 GO功能富集分析

GO（Gene Ontology）是一个生物信息学分析模型，定义用于描述基因功能的基因类以及这些概念之间的关系，包括细胞组分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）、生物学过程（Biological Process，BP）三个部分[15]。根据基因的GO注释，以人类基因为背景，以P＜0.01，Benjamini＜0.05为条件，利用DAVID 6.8基因功能分类工具（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）对DSS中收集的与AD相关的靶基因进行GO富集分析。

2.5 Pathway富集分析

在生物体内，不同基因相互协调行使其生物学功能，基于Pathway的分析有助于更进一步了解基因的生物学功能。本文以P＜0.01，FDR≤0.05为条件筛选数据[16]，并运用OmicShare（www.omicshare.com/tools）进行了Pathway富集分析。同时为了阐明当归芍药散治疗AD的作用机制，筛选出的靶基因被输入到AD-path⁃way通路图（KEGG号：map05010）中获得信号通路富集分析图。

3 结果

3.1 活性化合物鉴定

从TCMSP中收集DSS方剂中六味中药的化合物，其中当归有125种，芍药85种，川芎189种，白术55种，泽泻46种，茯苓34种，以OB≥30%，BBB≥-0.3，DL≥0.1为条件最终筛选出DSS的活性化合物51种，当归芍药散活性化合物信息见表1。

3.2 靶点预测

根据材料与方法2.2中所述，51种活性化合物中M28和M49没有预测靶点，剩下49种活性化合物共预测靶点377个，其中不同化合物可作用于相同的靶点，同一靶点也可能来自不同化合物，平均一种活性化合物对应约24个靶点，这也充分印证了当归芍药散的多靶点作用。与DisGeNET数据库中所获得的2245个AD相关性基因进行比较，377个预测靶点中有197个潜在的重合靶点，本文认为这197个靶点与DSS防治AD密切相关。

3.3 网络关系图

3.3.1 药物-化合物-靶点网络图

DSS中6种药物、49种活性化合物与377个靶点之间的相互作用关系以药物-化合物-靶点网络（Herbs-Compounds-Targets，H-C-T）网络的形式呈现（如图2）。该网络由434个节点和1210条边组成，其中圆形节点表示药物，六边形节点表示化合物，长方形节点表示靶点，围绕同一圆形节点的同色化合物表示属于同种药物，M19来源于当归和白芍，M43来源于白芍、川芎和泽泻。位于外圈的233个靶点与至少2个以上化合物连接，内圈的靶点则与更多的化合物相连。51个活性化合物中，22种化合物都具有20个以上的作用靶点，提示这些成分可能在DSS药效中起主要作用。如H-C-T网络图显示，其中圆形节点表示药物，六边形节点表示化合物，菱形节点表示靶点，围绕同一圆形节点的同色化合物表示属于同种药物，其中M19来源于当归、白芍，M43来源于白芍、川芎、泽泻。

3.3.2 “化合物-靶点-AD”网络图

“化合物-靶点-疾病”网络图提供了一种将化合物、靶点映射到人类疾病中，建立疾病相关基因与活性化合物相互关系可视化网络，直观显示疾病-化合物-靶点之间关系的方法。本文通过DisGeNET数据库获得与AD有关的197个潜在靶点，并与49个活性化合物建立AD相关性基因“C-T-AD”网络图（如图3）。所有化合物都与至少2个靶点相连，从图中可以看出ole⁃ic acid（M38，Degree=76）、EIC（M27，Degree=57）、DBP（M23，Degree=57）、beta-sitosterol（M19，Degree=41）、Methyl linolelaidate（M36，Degree=41）、METHYL LINO⁃LEATE（M35，Degree=41）、Exceparl M-OL（M29，De⁃gree=41）、Mandenol（M34，Degree=37）、DIBP（M25，De⁃gree=27）的自由度较高，说明这几种化合物在AD治疗中有更加重要的作用。同时，197个潜在靶点中有117个靶点与至少2个化合物相连，其中PTGS2（Degree=26）、GABBR1（Degree=20）、CHRM2（Degree=19）、CHRM1（Degree=19）、RXRA（Degree=16）、PTGS1（De⁃gree=13）、CHRNA7（Degree=11）具有高于 10的自由度，自由度越高，说明其参与网络中的生物功能越多，其生物学重要性越强，提示这7个靶点与AD治疗密切相关。

表1 当归芍药散51种活性化合物信息

图2 草药-化合物-靶点网络图

3.4 多靶点/多器官协作治疗AD的作用机制

3.4.1 靶基因-器官定位

图3 化合物-靶点-AD网络图

为阐明DSS药物作用途径和药物主要的靶器官，本文将获得的197个与AD相关性基因进行靶器官定位，并运用Cytoscape_v3.4.0建立AD相关性基因靶器官定位图（见表2，图4），发现有大量基因定位于肝脏、血液、心脏，脑，也是DSS治疗AD药效作用的重要靶器官。

3.4.2 GO功能富集分析

本文对197个与AD相关的靶点进行GOBP富集分析，选择最相关的20个生物学过程进行展示（见表3），结果表明DSS治疗AD的作用途径主要与对药物的反应、信号转导、炎症反应、缺氧反应、凋亡过程、衰老、记忆等有关（如图5）。

其中有29个基因富集到生物学过程“炎症反应”，有17个基因富集到生物学过程“凋亡过程”，分别有16个基因富集到生物学过程“衰老”和“应对缺氧”，此外有SLC6A4、HTR2A、PTGS2、DRD1、CNR1、CHRNA7等6个基因与“记忆”有关。因此，本文认为DSS在AD的治疗作用可能是影响某些生物学过程，如衰老、凋亡、记忆、抗炎、应对缺氧等。

3.4.3 AD相关信号通路分析

通过网络的建立，获得了AD相关性基因与当归芍药散药效成分之间关系的可视化图，为确定当归芍药散中活性化合物与AD靶点的相互作用，首先对AD的197个潜在靶点进行了pathway富集分析，给出了使用OmicShare工具的KEGG路径注释的整体图和富集的主要信号通路（见表4）；其次，根据KEGG路径数据库提供的阿尔茨海默病途径建立“AD通路图”。

表2 靶基因-器官定位数据

图4 DSS有效成分预测的与AD相关基因靶器官定位图

表3 GO功能富集数据

图5 GOBP富集分析

3.4.3.1 pathway富集分析

本文将获得的197个与AD相关性基因与人类整个基因组背景基因导入到OmicShare在线分析软件中，获得了目的基因相对于背景基因的富集统计图（如图6-A），本文针对于“信号转导”模块进行进一步分析获得了“靶点-信号通路网络图”（如图6-B）（图中节点圆圈大小根据中心度进行设定）。结果显示较多的靶点被富集到PI3K-Akt pathway（22个基因），cAMP sig⁃naling pathway（18个基因）和Calcium signaling pathway（16个基因）。

3.4.3.2 AD信号通路网络

14个蛋白靶点被定位到AD信号通络网络中（如图7），表明这些蛋白在AD中起着重要作用。AD发生与老年性斑块沉积和神经纤维缠结有关。β淀粉样蛋白（Aβ）是老年性斑块的主要成分，对细胞和细胞器功能有多种病理影响。细胞内Aβ的沉积破坏线粒体功能，引起神经元凋亡从而导致认知功能障碍[17]。DSS一些成分的靶蛋白（APP，PSEN，ApoE）与Aβ聚集和tau过度磷酸化密切相关，可能是其神经保护功能的体现。GSK3β过度激活导致过度或异常tau磷酸化破坏细胞质功能，干扰轴突运输，导致细胞死亡是AD的重要发病机制[18]。DSS 活性成分 DBP（M23）和 Myrican⁃one（M37）的药物靶点为GSK3β可能通过抑制tau过度磷酸化达到治疗AD的目的。此外，活性化合物betasitosterol（M19）靶向CASP3，CASP8和CASP9与凋亡通路密切相关，DSSactylenolideⅠ（M15），DSSactyleno⁃lideⅢ（M17）和Mandenol（M34）靶向TNF，DSSactyleno⁃lide Ⅰ（M15），Mairin（M33）和α-Amyrin（M50）靶向IL-1B与抗炎密切相关。因此，本文从AD信号通路图的富集分析发现DSS可能主要通过减少Aβ的聚集和抑制tau过度磷酸化以及抗炎和抗凋亡等方面发挥治疗AD的作用。

表4 信号通路富集数据

图6 AD相关性基因pathway富集分析。

图7 DSS预测靶点在AD-pathway信号通路中的富集图

4 讨论

近年来，中药网络药理学已成为一个集中药药理学、生物化学、基因组学和生物信息学为一体的新的药理学领域[19]。它提供了一个新的强大的工具来可视化分析草药、化合物、靶点和疾病的复杂的交互数据[19]。近年来报道了一些关于网络药理学分析中药治疗AD的研究，如Cai等使用网络药理学方法揭示了补肾益智汤治疗AD的潜在分子机制[20]。Qiang等对远志散活性成分分析及靶点预测构建了“有效成分-AD靶标”网络分析其治疗AD的分子机制[21]。Luo等建立了多个草药-化合物-靶点-信号通路互作网络模型来分析DSS治疗神经退行性疾病的作用机制[22]，其中报道了DSS主要通过抗炎，抗凋亡等途径治疗AD与本文结果一致。Fang等通过文献挖掘PubMed报道的前十种抗AD草本植物，基于系统的药理分析、从多个角度解释这些草药抗AD的作用机制[23]。这些研究基于多种药草的联合作用来探索中医药治疗疾病复杂的作用机理，为研究中药治疗AD的机制提供了很多有价值的信息参考。本文基于网络药理学分析方法下对DSS活性成分进行筛选，靶点预测和疾病相关性分析，可视化构建了草药-化合物-靶点网络和草药-化合物-靶点-AD网络，本文共获得了49种活性化合物的197个预测靶点与AD相关，网络图中自由度（degree）指与该节点相关联的边的条数，自由度高表明该化合物关联的靶点越多，是当归芍药散的重要药物成分[23]，我们发现DSS主要活性成分中oleic acid（M38，Degree=134）拥有最多的关联靶点，其次是 DBP（M23，Degree=106）和EIC（M27，Degree=105），表明这些化合物可能比草药-化合物-靶点网络中的其他化合物具有更重要的药理作用。同时，PTGS2（Degree=26）与化合物的关系最为密切，其次为GABBR1（Degree=20）和CHRM3（Degree=20）。H-C-T网络分析结果表明当归芍药散的活性化合物具有多靶点效应。与AD密切相关的基因[24-26]，如APP，ACHE，BACE1，GSK3B，HTR2A，MAOB，TNF 等都出现在网络中，体现了网络药理学预测的准确性。

老年性痴呆病位在脑，与五脏虚衰相关，其肝失疏泄，脾失健运，酿生痰浊血瘀而致痴呆。经方当归芍药散出自张仲景的《金匮要略》，其补血行气活血，健脾益气祛湿具有较好的治疗效果[27]。其中“痰浊”的生化指标体现为代谢紊乱、氧化应激、凋亡和炎症，本文通过DSS与AD相关性靶点的GO分析和pathway富集分析发现DSS治疗AD的作用途径主要与对药物的反应、信号转导、炎症反应、缺氧反应、凋亡过程、衰老、记忆等有关，富集的信号通路主要有PI3K-Akt signaling path⁃way，以及与炎症相关的TNF signaling pathway和NF-κB signaling pathway，与能量代谢相关的MAPK signal⁃ing pathway和AMPK signaling pathway等。这些结果从一定程度上对本文解释中医的施治理论给予了提示。

中医理论认为人体是一个有机的整体，没有一个器官是独立存在的，它们在结构上不可分割，在功能上协调一致、相辅相成，在生物学功能上相互作用，本文对所有靶基因进行器官定位发现，靶基因定位最多的为肝，其次是心脏和脑，DSS以补肝养肝为要，虽然中医学所说的“肝”，它不仅是指解剖学上的肝脏，更重要的是一个功能活动系统，是一较抽象的概念，如人的精神情志活动等都涉及中医肝的功能范围，但也涉及以肝与胆的功能失调和其经络循行部位所引起的病症为主，因此从一定程度上也能说明DSS治疗AD与器官“肝”存在密切关系。其次，肝是以代谢功能为主的一个器官，是机体实现抗氧化，能量代谢，蛋白质合成等生物功能的重要场所，DSS防治AD的药效靶点大量富集于肝说明其治疗机制与调节机体代谢紊乱密切相关，也从另一方面验证了最新的研究观点--糖脂代谢紊乱在AD发病中起重要作用而把AD称之为“3型糖尿病”[28,29]。本文结果提示中药方剂DSS对AD的作用机制并非只针对于病灶“脑”，与心脏，肝，肾等多器官协调作用有密切联系。

总之，本文通过系统药理学方法对DSS进行了综合分析，预测了DSS治疗AD的潜在靶点，我们将在接下来的实验中验证这些预测靶点的可靠性，并进一步了解DSS治疗AD的药效作用机制，并为中医药防治复杂疾病提供一种可能的研究方案。此外，研究还需要进行体内活性化合物的测试，以进一步评估其应用于临床的潜在可能性。