北京地区猪圆环病毒3型感染的检测及基因组遗传变异分析

孙 明，马 君，乔明明，刘巧荣，田新生，杨欣艳，孙胜永，陈西钊,2*

(1. 北京世纪元亨动物防疫技术有限公司，北京 100094； 2. 中国动物疫病预防控制中心，北京 100125)

猪圆环病毒(porcine circovirus, PCV)属于圆环病毒科(Circoviridae)，圆环病毒属(Circovirus)，为无囊膜的单股负链环状DNA病毒，是在哺乳动物细胞中能自主复制的最小病毒。猪圆环病毒目前有两个血清型：猪圆环病毒Ⅰ型(PCV1)和猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)[1]。PCV1对猪没有致病性，PCV2可致猪圆环病毒病(porcine circovirus associated disease, PCV AD)，包括断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)、猪皮炎与肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(porcine respiratory disease complex，PRDC)、繁殖障碍(reproductive failure)等有关，给养猪业造成了巨大的经济损失[2-3]。本研究从患PMWS的断奶仔猪体内检出圆环病毒3型的序列，并对其病毒分离和全基因测序，分析其培养特征和基因组的遗传变异情况，为PCV3在中国的流行病学调查以及有效防治提供科学的依据。PCV2最早在1985年被发现可导致多系统疾病，但属于零星发生，直至20世纪90年末才成为流行趋势，并遍布世界很多国家。我国于2001年首次报道该病[4]，目前已广泛流行，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。有人报道在猪、牛胃蛋白酶和啮齿类动物中检出PCV1和PCV2的DNA，这使得PCV2再次受到众多研究人员的关注。2016年Palinski等[3]和Phan等[5]首次报道了一种新的圆环病毒——PCV3。Palinski等[3]用PCR和IHC方法，从PDNS损伤的母猪皮肤、肺、肾、淋巴结、血清以及流产胎儿体内检出PCV3，推测PCV3可垂直传播。PCV3的Cap蛋白和Rep蛋白氨基酸序列与PCV2和蝙蝠圆环病毒相似性分别是37%和55%。Li等[6]报道，环形病毒和圆环病毒可能存在跨物种传播。翟少伦等[7]对猪圆环病毒感染人类的可能途径进行了剖析，不过这些推测需要进一步的试验验证和临床调查。我们针对这个新出现的病毒——PCV3从分子方面进行相关研究，分析其遗传变异特征，以研究PCV3与PCV2、PCV1以及其他物种的圆环病毒之间的亲缘关系，为PCV3的流行病学和防控研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 患猪临床情况

收集2016年12月至2017年11月期间，北京地区规模化养猪场73份临床表现繁殖障碍和严重呼吸道疾病猪的淋巴结、肺、脾和肾等组织，-70 ℃保存备用。

1.2 载体、菌株和主要试剂

pMD19-T克隆载体、Ex-Taq酶购自大连TaKaRa公司；DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；总DNA提取试剂盒为北京世纪元亨动物防疫技术有限公司产品，胶回收试剂盒为Omega产品。猪圆环病毒3型实时荧光PCR检测试剂盒、猪圆环病毒2型实时荧光PCR检测试剂盒购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司。

1.3 引物的设计与合成

根据GenBank上发表的PCV3和PCV2全基因序列分析，设计3对引物，由上海英骏生物技术有限公司合成，见表1。

表1引物序列

Table1Thesequenceoftheprimers

引物名称Primer name上游引物(5'→3')Sense primer下游引物(5'→3')Antisense primer产物位置Genome positionP1TAGTATTACCCGGCACCTCGGAAATTCATCAAATGGAACCCACCCAT1—880位P2TTGGTGGGATGGTTATA ATGGGGAGCCTCTTCTTTTTCTCCAGACCCA806—1 505位P3TGCCGTAGAAGTCTGTCATTCCAGTGCCCGGCACCAAAATGAGACACA1 381—2 000位

1.4 基因扩增

用DNA提取一份阳性病料，按照DNA试剂盒说明书提取病毒全基因组，按照以下程序进行基因扩增：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环后，72 ℃延伸10 min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后用OMEGA公司胶回收试剂盒回收纯化扩增的目的基因片段。

1.5 扩增产物的克隆及测序

分别将PCR扩增得到的3个片段连接到pMD19-T中，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞。用PCR方法筛选阳性克隆，将初步鉴定的阳性克隆送上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。

1.6 PCV3全基因组拼接以及序列同源性分析

应用DNAMan和DNAStar对测序序列进行拼接，并将其与PCV1、PCV2、PCV3以及其他物种圆环病毒基因组序列进行序列同源性分析、比对；并对其Rep蛋白和Cap蛋白氨基酸序列进行比对分析，绘制系统进化树。

2 结 果

2.1 2016—2017年北京地区PCV3检出情况

用猪圆环病毒3型和猪圆环病毒2型实时荧光PCR检测试剂盒进行检测，检测结果显示PCV2和PCV3阳性率分别为58.9%(43/73)和30.1%(22/73)，PCV3和PCV2混合感染率24.7%(18/73)。

2.2 PCV3基因组扩增

成功获得与预期大小相符的基因片段，结果见图1。大小分别为880、700和620 bp。

1、2和3分别代表P1、P2和P3引物扩增；M.DL2000 DNA相对分子质量标准1, 2, and 3 were amplified with P1, P2, and P3 primers, respectively；M. DL2000 DNA marker图1 PCV3全基因组克隆Fig.1 Clones of PCV3 genome

2.3 克隆鉴定和测序

重组质粒经PCR鉴定显示，成功将3个片段克隆到pMD19-T载体中。阳性质粒经测序、拼接，获得了PCV3全基因组序列，序列全长2 000 nt。该序列已经提交到GenBank上，登录号为MG546667，将该病毒命名为PCV3/CN/BJ-YH2016。基因组含有3个开放阅读框(ORF)，主要编码2种蛋白：复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap)。

2.4 基因组序列同源性分析

利用DNAMAN生物分析软件将PCV3/CN/BJ-YH2016基因组序列与NCBI上现有的PCV3全基因组序列进行比较分析，并绘制系统进化树(图2)。发现基因组序列与NCBI上的30株PCV3序列相似性为98.6%～99.3%。其中与PCV3/CN/Anhui-14/201611毒株相似性最低，和PCV3-US/SD2016毒株(KX966193)、PCV3/CN/Chongqing-148/2016(KY075991)、PCV3/CN/Chongqing-147/2016(KY075990)和PCV3/CN/Jiangxi-62/2016(KY075989)相似性最高。

与PCV2、PCV1以及其他物种的圆环病毒基因组序列系统进化分析显示，PCV3可能与水貂圆环病毒和蝙蝠圆环病毒亲缘关系密切，在一个大的分枝上，见图2。

图2 PCV3/CN/BJ-YH2016毒株与其他参考毒株全基因组进化分析Fig.2 Phylogenetic tree based on the complete genomes of PCV3/CN/BJ-YH2016 and other reference viruses

2.5 Rep遗传进化分析

分析现有的PCV3毒株，本分离株与美国毒株PCV3-US/MO2015(GenBank序列号KX778720)毒株的Rep蛋白氨基酸序列相似性最高(为100%)，与国内毒株PCV3/CN/Guangdong-SG1/2016(GenBank序列号MF589105)相似性最低(为95%)，有16个氨基酸变异，全部集中在5—23位氨基酸，与PCV3-US/MN2016、PCV3-US/SD2016和2164毒株的Rep基因推导氨基酸序列对比有3个氨基酸变异，分别位于44、122和187 aa位点。与PCV2、PCV1和BatCV相比，Rep氨基酸序列相似性分别为48%、46%和55%。Rep系统进化树显示，该分离株和蝙蝠以及鱼类圆环病毒在一个分枝上，亲缘关系较近(图3)。

2.6 Cap遗传进化分析

Cap蛋白氨基酸序列与美国毒株2164(KX458235)的相似性为100%，与其他毒株均有1～4个氨基酸发生变异，其中与PCV3-US/MO2015毒株相比，变异位点分别位于24、26、56和100 aa。该毒株Cap基因核苷酸序列与国内26个毒株以及国外7个代表毒株的Cap基因相比，核苷酸相似性分别为97.2%～100%和97.6%～100%，编码的氨基酸序列相似性分别为97.8%～100%和98.1%～100%；表明PCV3北京毒株和国内外PCV3具有较高的同源性，遗传关系较近。系统进化树显示该分离毒株属于3b亚群(图4)。

图3 基于PCV3 Rep基因序列同源性的遗传进化树Fig.3 Phylogenetic tree of PCV3 on Rep gene sequence homology

图4 基于PCV3 Cap基因序列同源性构建的遗传进化树Fig.4 Phylogenetic tree of PCV3 on Cap gene sequence homology

3 讨 论

PCV1普遍存在于猪群中而不致病，PCV2通常被认为是引起猪圆环病毒病的主要因素。Li等[6]报道在腹泻患者和健康人的粪便、人用疫苗及牛肉中检测到PCV2；称PCV2可能感染人类的路线包括食物传播(使用或者接触新鲜猪肉产品，食用未熟牛肉或者生鲜奶、喝生水)、接种感染、异种器官移植、空气传播，以突出公共卫生意义和物种交叉传播[8]。20世纪90年代中期，PCV2首次从加拿大断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的患病猪体内分离[9]，很快遍布世界各地。1993年PDNS在世界多个国家报道，并陆续在猪体内检测到PCV2，并认为PCV2是主要致病因素。后Thibault等[11]和Segalés等[12]报道从猪体内检测到的PCV2抗原不一致，这引发了人们对PCV2在PDNS中作用的猜测[3]。2016年，美国学者报道了一种新的圆环病毒基因型——PCV3，该病毒从出现PDNS症状、流产仔猪以及患PMWS的断奶仔猪体内分离得到，而PCV2检测为阴性[3, 5]。这提示PCV3可能为导致PDNS、PMWS以及繁殖障碍的病原之一。

由于PCV2对养猪业造成了很大的经济损失，故应对这个新出现的PCV3进行更深入的研究，以证明其在PCVADS中的重要性。Phan等[5]从3例出现厌食、体重下降、关节和淋巴结肿大，心损伤和多系统炎症(肠炎、肺炎)等症状的断奶仔猪体内检测出PCV3。Palinski等[3]从患PDNS的母猪流产木乃伊胎和死于PDNS的母猪体内检测到PCV3，他们用PCR和IHC方法，从患PDNS样损伤的母猪的皮肤、肺、肾和淋巴结中检出PCV3，而未检测到PCV2，他们对271份猪呼吸系统疾病猪进行了qPCR和ELISA检测，分别检出阳性34份(12.5%) 和83份(55%)，表明PCV3是侵蚀呼吸系统的。2016年12月至2017年11月，本实验室对北京地区规模化养猪场临床表现繁殖障碍和严重呼吸系统疾病的患猪进行了PCV2和PCV3的检测，结果显示，PCV2和PCV3阳性率分别为58.9%(43/73)和30.1%(22/73)，PCV3和PCV2混合感染率24.6%(18/73)，此数据与Ku等[10]的研究结果相一致。本研究充分证明，北京也存在PCV3的感染。随之对养殖场进行调研，结果发现，大部分养殖场管理不当，疫苗免疫不规范，未定期对猪进行PCV2免疫，卫生情况欠佳，发病猪主要集中在20～30日龄的保育猪，保育猪出现呼吸道症状，腿关节肿大，死亡率高达30%，母猪流产，产木乃伊胎。这些结果说明PCV3在不孕、PDNS和PMWS中扮演着重要的角色。为了进一步研究PCV3遗传变异特征，本研究选取1份PCV3阳性样品进行全基因组测序。

测序结果和遗传进化分析显示，该病毒基因组全长2 000 bp，并将病毒命名为PCV3/CN/BJ-YH2016。其与NCBI上的30株PCV3基因组序列相似性为98.6%～99.3%；基因组序列系统进化分析显示，PCV3与PCV2、PCV1以及水貂圆环病毒和蝙蝠圆环病毒在一个大的分枝上，亲缘关系密切。Rep蛋白氨基酸序列分析显示，该毒株与美国毒株PCV3-US/MO2015毒株的相似性最高，为100%；与国内毒株PCV3/CN/Guangdong-SG1/2016相似性最低，为95%；PCV3与PCV2、PCV1和BatCV相比，相似性分别为48%、46%和55%；系统进化树显示，该分离株和犬圆环病毒、鹅圆环病毒、鸭圆环病毒以及蝙蝠圆环病毒在一个分枝上，亲缘关系较近。这与Palinski等[3]和Phan等[5]的研究结果相一致。Phan等[5]认为：无论PCV3在猪体内一直存在还是从别的物种传播引起，仍是未知数，这需要对历史样品进行研究分析。Palinski等[3]根据PCV3、PCV2、PCV1和其他物种的圆环病毒系统进化树提出：PCV3、PCV2、PCV1和BatCV-2(蝙蝠圆环病毒)可能拥有共同的祖先，然而这种推测缺少有力证据[3,13]。

Cap基因序列比对结果显示，北京毒株PCV3/CN/BJ-YH2016与国内26个毒株以及国外7个代表毒株的Cap基因相比，核苷酸相似性分别为97.2%～100%和97.6%～100%，编码的氨基酸序列相似性分别为97.8%～100%和98.1%～100%；表明PCV3北京毒株和国内外PCV3具有较高的同源性，遗传关系较近；系统进化树显示目前国内外毒株主要是3a和3b亚型，本分离毒株属于3b亚群。

本研究表明PCV3在北京地区广泛存在，且患病猪场一般存在管理不当，疫苗免疫不规范，卫生情况欠佳，且出现24.6%患猪同时感染PCV2和PCV3，并伴有细菌感染。有报道PCV3和PCV2毒株的抗原交叉保护性较低，现有的PCV2疫苗无法为PCV3感染提供有效的免疫保护作用[2，14-15]。养殖场之所以出现30%的死亡率，可能与患猪感染PCV2、PCV3并伴有细菌感染有关，从而导致发病猪较高的死亡率。因此，养殖场应加强卫生管理、按时接种疫苗，并定期进行PCV3的流行状况调查，以有效防控PCV3的流行。

4 结 论

北京地区猪群中已存在PCV3感染，并对其进行了基因组测序，基因组遗传分析结果显示，PCV3全基因组长2 000 bp，并命名为PCV3/CN/BJ-YH2016。其Rep蛋白氨基酸序列与美国毒株PCV3-US/MO2015的相似性最高，为100%；与中国毒株PCV3/CN/Guangdong-SG1/2016相似性最低，为95%；Cap蛋白氨基酸序列与美国毒株2164的相似性为100%，与其他毒株相比均有4个氨基酸发生变异。这些数据将为研究这种新型病毒——PCV3的遗传变异和流行病学特征提供分子生物学依据。