牛轮状病毒VP4、VP6、VP7基因分子生物学研究进展

梁浩勤，李琼毅，赵克学，邓盈盈，赖露菊，魏锁成，冯若飞

(1.西北民族大学 生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；3.甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃 兰州 730030)

轮状病毒性胃肠炎(Rotavirus gastroenteritis, RVGE)是由轮状病毒(Rotavirus, RV)引起的流行广泛的人畜共患病，也是多种幼龄动物及婴幼儿的一种急性肠道传染病，以腹泻和脱水为特征，病死率可达50%[1].在发展中国家，由轮状病毒引起的急性肠炎每天死亡数约2 000人[2].轮状病毒属于呼肠孤病毒科，为无囊膜双链RNA病毒，直径大约60 nm～80 nm，是一个对称的20面体，电镜下呈典型的“车轮状”，故称为轮状病毒[3].RV分为11个基因节段，分别编码了6种结构蛋白(VP1-VP4、VP6、VP7)和6种非结构蛋白(NSP1-NSP6).在三层RV颗粒中，中间层由VP6蛋白(45 kDa)组成，位于最外层由VP4和VP7蛋白组成，内部核心蛋白VP2，围绕着RV的双链基因组[4]；VP7和VP4蛋白决定RV的G型与P型以及它的毒力；NSP1-NSP6非结构蛋白在轮状病毒的复制、转录、组成病毒复制酶、出芽等过程中发挥着重要的作用.

1 牛轮状病毒的基因型和血清型

2008年Matthijnssens J等比对了GenBank中已知的不同RV毒株每个节段ORF区的同源性，并对每个节段的基因型设定同源性临界值，由此可以判断每个毒株的基因型[5].不同基因节段对应不同的基因型，按照下列的排列顺序对A群轮状病毒进行新的分类和命名VP7-VP4-VP6-VP1-VP2-VP3-NSP1-NSP2-NSP3-NSP4-NSP5.至今已发现27种G型，37种P型[4].在牛轮状病毒中发现的G型为G1-G3、G5、G6、G8、G10、G11、G15、G17、G21、G24， P型为P[1]、P[3]、P[5-7]、P[11]、P[14]、P[17]、P[21]、P[29]、P[33].经研究证实G6、G8、G10和P[1]、P[5]、 P[11]基因型在BRV中最常见[6].

以牛A组轮状病毒G6为主流行的血清型(40/53，75.4%)，经常检测到的结合型为G6P[11](60.3%)和G10P[11](24.5%)[7].前期的研究表明,我国BRV的主要G血清型为G6(54.7%)和G10(15.1%)；主要的P基因型为P[5](52.8%)和P[11](18.9%)，主要的结合型是G6P[5](28.3%)、G6P[5]P[11](5.7%)、G10P[5](5.7%)及G10G6P[5](5.7%)[8].

Peter等应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了德国家养动物和伴侣动物425份粪便样中A、B和C组RV，在85.2%的样本中检测到BRV[9].基因分型结果显示G6P[5]为经常检出的基因型，高达67.3%，其次是G6P[11](13.9%)和G10P[5](4.0%)[9].目前，根据研究者的用途，已经研发了几种针对轮状病毒G和P分型的测定方法，且它们的特异性和敏感性存在显著差异[7, 10-12].

2 VP4结构蛋白的功能及分子特征

2.1 VP4结构蛋白的功能

VP4是病毒穗蛋白，由基因片段4编码[13, 14]，约88 kDa，它决定了宿主细胞嗜性，并携带P(对蛋白酶敏感)血清型.VP4在酶裂解时病毒传染性增加并快速病毒内化成两个亚单位——VP8 (28 kDa)和VP5(60 kDa)[13, 15, 16].VP4除了决定P血清型研究，还与许多重要的生物学功能联系在一起.VP4是许多病毒株的血凝素，被认为是一种毒性决定因素，大多数研究表明VP4是轮状病毒主要的细胞附着蛋白.轮状病毒在感染许多动物(除人类外)时，需要细胞唾液酸的作用才能发挥血凝、细胞结合和具有传染性的功能[17].不同的VP4血清型之间还存在交叉保护，是疫苗研究最有前途的蛋白之一[18].但目前还未研制出用于BRV的基因工程亚单位疫苗.

2.2 VP4基因的分子特征

轮状病毒感染宿主的过程中VP4被胰酶内化成了带氨基末端的VP8蛋白和带羧基末端的VP5蛋白，进而提高了病毒感染性[19].VP8包含血凝素域(氨基酸位点93-208)[20]，覆盖了一个抗原区域(氨基酸位点79-192)[21].VP5包含一个假定的细胞融合区域(氨基酸位点384-401)和一个抗原区，其中细胞融合区为辛德毕斯病毒潜在的结合区域[22]，抗原区环绕着氨基酸位点305，细胞融合区和氨基酸位点428-458[21].Mawatari等研究了2003—2010年日本山形县检测出的6种轮状病毒C(RCVs)与之前研究中发现的2种RCV的全长核苷酸序列之间的遗传多样性，发现VP4基因可明显分为两种谱系.在谱系I和II之间VP4核苷酸序列同源性为83.7%～ 84.8%[23].

3 VP6结构蛋白的功能及分子特性

3.1 VP6结构蛋白的功能

VP6是RV中最丰富和具有免疫原性的蛋白[24]，在RV株中高度保守[25].根据VP6将轮状病毒目分为8组(A-H)[26].1997年发现新的RV能感染成人，这种新病毒被命名为新的成人腹泻轮状病毒(ADRV-N)[27].最近，Wakuda等从猪身上又分离出了一种相关病毒[28].RVA、RVB和RVC是已知感染人类和动物的，而RVD、RVE、RVF和RVG只感染动物[29].

3.2 VP6基因的分子特征

VP6型三聚体构成六边形，并进行高级结构组装，在不同条件下分别构成VP6纳米管(VP6T)和纳米球(VP6S)[30].rVP6具有高度的免疫原性[31]，它被作为异种蛋白抗原和基因融合疫苗的载体或递呈平台，能够提高外来抗原的免疫反应[32].VP6在不同的pH条件下是稳定的.在口服的时候，它被靶向作用于肠细胞，给药物混合物运输到胃肠道提供了一个新前景[33].2012年，Jelle等将400多个VP6 ORF序列和7个从鸡中分离出的RVD菌株的VP6 ORF片段，构建了系统发育树和成对的特性频率图[26].

4 BRV VP7结构蛋白的分子生物学特征

4.1 VP7结构蛋白的功能

早期的研究表明VP7是一种轮状病毒细胞附着蛋白[34]，但后期两个实验室报告，感染轮状病毒的细胞裂解物中有一种蛋白被抗血清阻断和吸附，并被吸附在MA104细胞单分子上[16, 35].后来发现这种蛋白是非结构蛋白NSP2，而不是VP7[36].VP7仍有可能在细胞附着中起次要作用[37].

4.2 VP7基因的分子特征

Isanaka等在印度西北部温带喜马拉雅地区的一腹泻小牛中发现了一种罕见的牛RVA菌株，命名为RVA/Cow-wt/IND/M1/09/2009.对该RVA菌株完整基因组序列的检测显示，在典型的牛RVA基因型主干(I2-R2-C2-M2-A11-N2-T6-E2-H3)上有一个不寻常的G-P组合[38].M1/09的VP7基因与猴株(RVA/ simian-tc/USA/RRV/1975/G3P[3])显示了73.8%的核苷酸序列一致[38].研究人员广泛研究了印度轮状病毒的分子流行病学[39]，印度的各个城市中G9菌株的高发率高达15%.在最近SII主导的与印度国立霍乱及肠道疾病研究中心合作的一项研究中，印度G9P[4](27%)、G1P[8](18%)和G2 P[4](14%)是研究人群中主要的基因型.

5 RV疫苗研制

5.1 减毒活疫苗

5.1.1 RotaTeq减毒活疫苗

在美国国家卫生研究院(NIH)技术转让后，印度开发了一种冻干人—牛重组五价轮状病毒疫苗(RotaTeq/BRV-PV)[40].冻干的RotaTeq是一种耐热的疫苗，可以在低于25 ℃环境中储存30个月[41].RotaTeq包括了5种人和牛宿主的重配RV，其中4种重配RV均表达牛RV亲代的吸附蛋白(P7)，还分别表达人RV亲代株外壳蛋白G1、G2、G3、G4；第5种重配RV表达人RV的亲代株吸附蛋白P1[42]和牛RV亲代株外壳蛋白G6.RotaTeq可有效预防G1～ G4引起的婴幼儿RVGE.在澳大利亚， RotaTeq已成为常规疫苗接种计划的一部分[43].

除了冻干的BRV-PV，印度还开发了液体BRV-PV (LBRV-PV)，这将给使用者提供一个额外的选择.LBRV-PV制作工艺几乎与冻干的BRV-PV相同，它与传统疫苗一样需要在2 ℃～8 ℃储存.该新疫苗在成人中进行了一期临床研究，结果显示GLP毒理学研究中没有出现安全问题，提示了LBRV-PV在成人中是安全且耐受性良好的.该疫苗将在婴儿身上进行下一步临床开发应用[44].

5.1.2 Rotarix减毒活疫苗

Rotarix是在美国获得许可的第三种轮状病毒疫苗[40]，第一个是Rotashield，由于它接种后导致肠阻塞几率增加，已由制造商撤回[45].Rotarix是一种单价轮状病毒疫苗，是人RV G1P[8]型RIX4414减毒后(89-12株)获得[46]，并于2012年5月引入了加纳国家扩大免疫规划(EPI)中[47].经一些拉丁美洲国家鉴定，Rotarix对G1、G2、G3、G4、G9均具有保护效力，且无肠套叠症状[48].

5.2 亚单位疫苗

5.2.1 诺如病毒—轮状病毒联合亚单位疫苗

诺如病毒(Norovirus, NoV)和RV是最常见引起幼龄儿童病毒性肠胃炎的病因，为了消除NoV和RV引起的胃肠炎，婴幼儿需要在出生后不久接种疫苗.尽管NoV病毒样颗粒(VLPs)疫苗正在被广泛研究，但仍不能通过疫苗接种来预防.当前使用RV疫苗是减毒活疫苗病毒的潜在安全问题，如肠套叠和脱靶的风险.研究灭活的RV亚单位疫苗是必要的.Malm等开发了一种联合疫苗候选疫苗，针对NoV和RV儿童胃肠炎，由NoV VLPs和RV VP6组成[49].在小鼠模型中，联合疫苗诱导了强烈的体液免疫和细胞免疫[50].除此之外，该研究还证明了VP6可以作为NoV抗体的一种体内佐剂[51, 52]，使得NoV-RV联合亚单位疫苗能够达到一举两得的效果.

5.2.2 BRV-TV四价人—牛重组轮状病毒疫苗

BRV-TV是由美国国立卫生研究院过敏与感染研究所(NIAID)自主研发的一种含有4种重组病毒的疫苗，其VP7基因为人的G1, G2, G3或G4血清型和10个英国牛轮状病毒株的基因[53].这种疫苗安全且不影响常规儿童免疫接种的免疫反应.Vesikari等人在芬兰将BRV-TV与恒河猴四价疫苗进行比较(RRV-TV，后来获得RotaShield许可).结果证明两种疫苗都同样有效，但BRV-TV的反应性比RRV-TV小.在研究中，97%的婴儿对疫苗产生了免疫反应，BRV-TV对严重轮状病毒肠胃炎(severe rotavirus gastroenteritis, SRVGE)有90%的疗效[40].尽管这项研究的规模有限，但清楚地反映了BRV-TV的免疫原性、安全性和有效性.

5.2.3 病毒样颗粒疫苗

1996年，Conner等在昆虫细胞中制备了表达牛RF VP2基因和SA11 VP4，VP6和VP7蛋白的重组杆状病毒疫苗，并分别对小鼠和家兔进行了免疫，得到了一种有效的免疫原[54].

5.2.4 研发中的基因工程亚单位疫苗

Wei Suocheng等从感染牛轮状病毒(BRV)菌株GSB01的MA104细胞中提取总RNA.利用实时荧光定量PCR (qPCR)扩增BRV VP7基因构建了pET32a-VP7和pET32a-VP7-LTB(大肠杆菌不耐热性肠毒素B亚单位)，并诱导表达了蛋白.将其作为抗体，免疫小鼠，制备了鼠多克隆抗体.研究结果显示,该融合蛋白具有优良的免疫原性，能够保护小鼠免受BRV感染[55].Gonzalez等研究了杆状病毒表达VP6重组蛋白，并用初乳模型对其进行了评估.结果提示，这种疫苗能够在不产生中和抗体(Nab)的情况下保护犊牛免受病毒攻击[56].这些重组蛋白可用于进一步开发高效的BRV亚单位疫苗.

6 小结

VP4、VP6、VP7是BRV重要的抗原蛋白，在轮状病毒的诊断和研制疫苗方面具有重要的指导意义.VP4作为刺突蛋白，在机体中产生抗VP4的抗体，能够有效阻断轮状病毒的吸附和进入胞内的过程.VP6进入机体可以刺激机体免疫反应，产生的IgA与多聚免疫球蛋白受体(plgR)结合，经转运与病毒颗粒结合，进而抑制病毒的转录和复制[57].VP7刺激机体产生的中和抗体能够阻断病毒脱壳，从而抑制病毒复制[58].世界各国很早就开始了轮状病毒基因工程疫苗的研制，迄今轮状病毒疫苗研制已经取得很大进展，现有减毒活疫苗、病毒样颗粒(VLP)疫苗、重组亚单位疫苗等，其中VP4、VP6、VP7作为抗原的多种重组亚单位疫苗也相继进入临床试验[40, 59, 60].随着新疫苗的进一步研发和多种动物模型的成功建立，经济有效的轮状病毒新疫苗终将会成功研制.