TGFβ/BMPs信号通路相关基因在运动干预骨重塑中的研究

杨永杰 高丽 章岚

摘 要：目的：研究水平跑台训练后生长期大鼠PBMCs中TGFβ/BMPs信号途径的Hes1、Gpnmb、Col1a1、 Mmp8、Mitf、Smad7和Klf4mRNA表达水平，探索上述基因表達变化与骨重塑状态的关系。方法：24只2月龄SD雄性大鼠随机分成对照组和运动组，每组各12只。运动组以25 m/min， 50 min/d，5 d/w水平运动12 w。训练结束后测量离体大鼠胫骨BMD及骨形态；用QRT-PCR检测PBMCs中Hes1、Gpnmb、Col1a1、Mmp8、Mitf、Smad7和Klf4mRNA表达。结果：与对照组相比，运动后大鼠胫骨的长度和近端BMD、BMC及厚度变化均无统计学意义。而PBMCs中Hes1、Gpnmb和Col1a1 mRNA表达上调，Mmp8 mRNA表达下调，Mitf、Smad7和Klf4表达未发生显著变化。结论：运动后PBMCs中Hes1、Gpnmb、Col1a1、Mmp8、Mitf、Smad7和Klf4 mRNA表达变化能比较敏感地反映骨重塑状态，提示上述基因可作为反应运动对骨重塑影响的候选分子标记。

关键词：生长期大鼠；跑台运动；PBMCs；骨重塑；TGFβ/BMPs

中图分类号：G804.7 文献标识码：A 文章编号：1006-2076（2018）02-0070-05

Abstract：Objective： To explore the involvement of the TGFβ/BMPs pathway related genes Hes1， Gpnmb， Col1a1， Mmp8， Mitf， Smad7 and Klf4 of peripheral blood mononuclear cells （PBMCs） in growing rats with treadmill training， thus to uncover the relationship between the Genes and bone remodeling caused by exercise. Methods： Two-month-old male Sprague-Dawley （SD） rats were randomly divided into two groups： control group （n=12） and exercise group（n=12）. The rats in the exercise group received leveling treadmill running treatment 5 days per week for 12 weeks according to the exercise regimen consisted of running at 25 m/min for 50 min each day. The final training was finished. Then the bone mineral density （BMD） and the morphological change of tibia was measured. PBMCs was harvested， and the mRNA expression of Hes1， Gpnmb， Col1a1， Mmp8， Mitf， Smad7 and Klf4 in PBMCs were detected. Results： Compared with the control group， no effect was found on the BMD and the morphological change of the tibia in exercise group. While the treadmill training up-regulated the Hes1， Gpnmb and Col1a1 mRNA transcription， down-regulated the Mmp8 transcripts， but had no effect on Mitf， Smad7 and Klf4 transcription. Conclusion： The mRNA transcript alteration of genes Hes1， Gpnmb， Col1a1， Mmp8， Mitf， Smad7 and Klf4 in PBMCs was more sensitive to exercise， and these genes may serve as molecular marker candidates for bone remodeling.

Key words：growing rats； treadmill； PBMCs； bone remodeling； TGFβ/BMPs

青春期适当地运动可提高峰值骨量，预防骨质疏松，但运动不当则不利于健骨。运动对骨密度和骨量的影响在短期内不易检测到，故对骨密度和骨量的检测不利于快速有效科学地指导健骨运动。显示骨密度和股形态的测定指标在运动干预骨重塑中灵敏度低，反映骨代谢的分子标记可及时监测运动干预骨代谢的变化，但在机械应力下能反映骨代谢的分子标记尚待研究。β转化生长因子（transforminggrowth factor-beta，TGF-β）/骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）信号转导途径在骨代谢过程中发挥着极其重要的作用[1]。转录抑制因子（Hairyand enhancer of split homolog-1，Hes1）[2]、非转移性黑色素瘤糖蛋白B （Glycoproteinnonmetastaticmelanomaprotein b，Gpnmb） 基因及其蛋白Osteoactivin（OA）[3]、Col1a1[4]、基质金属蛋白酶8（matrix metalloproteinase，Mmp8）[5]、小眼畸形相关转录因子（Microphthalmia-associated transcription factor，Mitf）[6]、Smad7[7]和Krüppel样因子4 （Kruppel-like factor 4，Klf4）[8-9]参与TGFβ/BMPs信号途径，对骨重塑起作用。

外周血单个核细胞 （peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）主要指淋巴细胞和单核细胞，均参与骨代谢过程调节[10-11]。先前我们已对PBMCs中wnt信号途径相关骨重塑基因进行了报道[12]。有关运动对PBMCs中TGFβ/BMPs信号途径骨代谢相关基因的影响尚未见报道。骨重塑是个复杂过程，TGF-β/ BMPs信号途径与WNT信号途径在骨重塑中有交互作用。研究PBMCs中TGF-β/ BMPs信号途径中作用，为研究运动后不同信号对骨重塑的调节具有重要意义。

山东体育学院学报第34卷第2期2018年4月 杨永杰，等 TGFβ/BMPs信号通路相关基因在运动干预骨重塑中的研究No.2 2018本文对2月龄雄性SD大鼠进行12周跑台训练，观察其胫骨骨密度及形态学变化，并分离PBMCs以检测TGFβ/BMPs信号途径相关基因Hes1、Gpnmb、Col1a1、 Mmp8、Mitf、Smad7和Klf4的mRNA表达变化，为运动健骨提供理论依据。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

24只2月龄雄性SD大鼠，体重247.9±8.0克（中国医学科学院医学实验动物研究所）。单笼饲养，自由饮食，环境温度24℃±2℃，相对湿度55%±5%，每天保持12 h光照。适应性喂养后被随机分为对照组（n=12）和运动组（n=12）。

1.2 研究方法

1.2.1 运动方案

对照组大鼠自然笼养，运动组大鼠在动物跑台上进行水平跑训练12 w，5 d/w。运动从第1周10 m/min，10 min/d开始到第4周最后逐渐增加到25 m/min，50 min/d。5～12周维持25 m/min，50 min/d这一强度[12]。

1.2.2 胫骨的获取、胫骨形态测量和骨密度检测

最后一次运动训练结束24 h后，乙醚麻醉大鼠，剥离胫骨，测量胫骨长度、近端厚度与宽度（精确到0.02 mm）。用DEXA、XR-600骨密度仪检测离体胫骨的近端骨密度，检测如图1所示。

1.2.3 外周血液PBMCs获取、总RNA的提取和QRT-PCR检测

腹主动脉取血。同组的随机5只大鼠血液等量充分混合以平衡个体差异，每组分别取2 ml血液，按照大鼠外周血液单个核细胞分离液（GE healthcare）试剂盒说明分离PBMCs。利用总RNA提取试剂盒（OMEGA）提取总mRNA，纯化后质检（A260/A280≥1.90；总量≥1 μg）。用Primer5.0软件设计引物（见表1），以β-Actin作为参照，取纯化后总RNA（500 ng）用SYBR-Green （Roche）在实时定量PCR仪（Bio-Rad）进行QRT-PCR。

1.2.4 统计学分析

形态学数据用spss11.1中独立样本t检验进行分析，所有数据采用mean±SD表示， 以P<0.05为差异显著。QRT-PCR扩增的mRNA水平用2 - △△CT表示， 2 - △△CT值>2（或<0.5）为表达具有显著性差异。

2 研究结果

2.1 跑台训练结束后大鼠胫骨骨密度及其形态的比较

由表2可知：12周水平跑台训练后，与对照组相比，运动训练后大鼠胫骨长度及胫骨近端厚度、宽度和BMD变化倍数分别为1.00、0.98、1.00和1.01，变化都不具有统计学意义。上述结果表明该强度的持续耐力运动对健康生长期雄性大鼠胫骨的BMD及胫骨形态影响不大。

2.2 QRT-PCR检测Hes1、Gpnmb、Col1a1、 Mmp8、Mitf、Smad7和Klf4基因mRNA的表达变化

对照组和运动组PBMCs中Hes1、Gpnmb、Col1a1、Mmp8、Mitf、Smad7和Klf4的mRNA表达QRT-PCR检测结果如表3所示。与对照组相比，运动训练后大鼠PBMCs中基因Hes1、Gpnmb和Col1a1的mRNA表达上调，表达变化倍数分别为2.12、4.01和5.26；基因Mmp8的mRNA表达则下调，表达变化倍数为0.22，Mitf、Smad7和Klf4的mRNA表达变化倍数分别为1.18、1.64和1.23，虽略有增加但不具有显著性差异。其中Col1a1和Mmp8的表达倍数变化大于或等于5。

3 讨论

3.1 跑台运动对生长期大鼠胫骨的BMD及形态的影响

生长期合理的耐力运动均使骨形成增加。我们已报道在本实验运动方案下水平跑台训练后骨微结构改善[12]，这与Ju等[13]的结论一致，即本实验运动方案可使骨质改善。但运动后胫骨近端骨密度和胫骨的形态没有检测到显著性变化，这与我们已报到的该强度运动对整体骨密度及骨矿含量和股骨骨密度的影响结果相同[12]。这些结果揭示骨密度和骨形态等指标的检测灵敏度低，不利于及时反映运动对骨重塑的干预。

3.2 跑台运动后Hes1、Gpnmb 、Col1a1、Mmp8、Mitf、Smad7和Klf4基因表达水平

经典TGF-β/ BMPs 信号转导途径与骨重塑密切相关[14-15]；TGF-β/ BMPs通路还可与其他骨代谢相关通路如 WNT、MAPK、NOTCH、HEDGEHOG等交互作用[16]。Hes1[2]、Gpnmb[1，3] 、Col1a1[4] 和Mitf[6]是TGF-β/ BMPs 信号转导途径的下游靶基因；Mmp8、Smad7和 Klf4[8-9]可调节TGF-β/ BMPs 信号转导途径[5]，它们都参与骨重塑调节。

3.2.1 跑台运动后Hes1、Gpnmb、Col1a1和Mmp8基因表达水平的变化

Hes1是NOTCH经典信号的重要下游靶基因[2]。Hes1调节成骨细胞分化的关键转录因子Runx2基因的转录活性[17]。骨髓NOTCH信号可通过抑制破骨细胞的发育抑制骨的重建 [18]。同时Hes1 也是TGF-β/BMPs信号途径的靶基因。TGF-β/BMPs信号通路活化后上调 Hes1 基因的表达 [1-2]。据公认，Gpnmb/OA在生理和病理条件下正调节成骨细胞的分化 [19-20]。OA蛋白在BMP-2的下游起作用，敲除Gpnmb可部分地减小BMP-2对成骨细胞分化和功能的效果[1，20]，OA和TGF-β1之间可能存在关联[3]。OA也可调节破骨细胞分化和/或活性，是破骨细胞分化和存活的负调节物[21]，但抗体中和抑制OA的功能可降低破骨细胞的细胞大小、细胞核数量、融合和骨吸收活性 [22]。Gpnmb突变或OA被抗体阻断会抑制破骨细胞的功能，降低骨转换 [3]。Col1a1是成骨细胞的特异性基因[23]，编码Ⅰ型胶原，促进骨形成 [24]。在间充质细胞、前成骨细胞和成骨细胞中均可检测到Col1a1表达。I型胶原在TGF-β与受体结合后合成增加，参与骨和软骨的合成。Mmp8是 Mmps家族中的成員，其蛋白MMP8对I型胶原和 II 型胶原有很强的降解作用。MMP8通过调节纤调蛋白（整合素）的降解调节TGF-β/ BMPs 信号转导途径[5]。MMP8抑制造血干细胞和祖细胞迁移及粘附于成骨细胞[29]。

据研究I型胶原al链基因对变化的应力刺激非常敏感，新生的成骨细胞敏感度高[25]，如冲击波诱导新骨形成时成骨细胞中Col1a1表达增加 [26]。当受到BMP-2和机械负荷刺激时成骨细胞提高Col1a1表达[27-28]，并释放PGE2以响应机械负载。适度的运动强度可以促进骨胶原形成，大强度运动则可使胶原纤维出现断裂。跑台运动后24 h我们检测到PBMCs中Col1a1的mRNA表达增加，这与已有报到一致[27-28]。Mmp8的表达受应力刺激的影响。体外实验表明周期性张应力可诱导牙周膜细胞中Mmp8表达增强 [30]。在我们的运动模型中，与对照组相比，运动后24 h大鼠PBMCs中Mmp8的mRNA表达下降，而同时Col1a1表达升高，提示运动训练24 h后，成骨作用增强，这也与已有的骨微结构研究相符[12-13]。同时我们还检测到Hes1和Gpnmb基因的mRNA表达增加，表明骨转换增加，且机体内环境有利于骨形成。这与已有对运动训练后骨微结构的变化报道相符[12-13]。目前对应力刺激下骨组织和PBMCS中Hes1和Gpnmb表达的变化尚未见报道。

3.2.2 跑台运动后Mitf、Smad7和Klf4基因表达水平的变化

MITF可能是破骨细胞功能和骨吸收的主要调节剂[6]，调节破骨细胞晚期分化。TGF-β增强RANKL诱导的Mitf表达的水平。Mitf通过调节破骨细胞吸收功能至关重要的基因（如Trap，组织蛋白酶K和Ostm1等）的表达，促进破骨细胞的分化。SMAD7是TGF-β家族通用抑制剂。抑制SMAD7的表达可通过经典和非经典途径促进骨形成[31]。但也有研究证明小鼠中SMAD7功能的部分丧失导致骨形成受损，骨吸收增强，故SMAD7被认为是成骨和破骨细胞发生之间的新型关键调节因子[32]。KLF4抑制成骨细胞矿化，并在体内和体外调节成骨基因的表达。成骨细胞转导了KLF4的小鼠其破骨细胞成熟显示严重的缺陷。野生型骨髓衍生巨噬细胞与表达KLF4的成骨细胞共培养表现出多核破骨细胞形成的减少。KLF4过度表达下调了成骨细胞合成和分泌的细胞外基质分子，干扰了细胞-基质相互作用进而影响到破骨细胞成熟[9]。有研究表明，新鲜骨折愈合过程中，KLF4蛋白与Smad7启动子相互作用。在原发性肝癌中KLF4可通过诱导Smad7启动子活性，激活Smad7转录来抑制致癌性TGF-β信号[8]。

在本实验运动后24 h Mitf的mRNA表达没有发生显著性变化。Mitf不仅受到TGF-β信号的调节，它也是肌腱膜纤维肉瘤癌基因B型（v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene family protein B，Mafb）（表达变化2.11倍，未发表）调控的靶基因，受到Mafb的负调控。MAFB是破骨细胞分化的主要负调节物，独立于TGF-β在骨发育中独立起作用[33]。在由RANKL进行诱导的破骨细胞分列的过程中，Mafb表达水平下降。Mafb表达增加增强了对Mitf表达的负调控，骨重塑状态趋向于以成骨为主，这也与已有的骨微结构研究相符[12-13]。Mitf表达是否对机械应力刺激敏感目前尚未见报道。

Smad7的表达对机械应力刺激敏感。据研究Smad7在牵张成骨早期及骨组织破坏最严重的部位表达最高，并高于正常组织，到中晚期Smad7表达下降，其表达量与骨愈合部位骨密度成反比。但也有学者认为，Smad7在早期实际含量较基础水平减少，随后含量又不断回升至正常水平[34]。创伤后瘢痕愈合中组织中Smad7较正常皮肤组织含量低，但压应力治疗时Smad7表达上调。Klf4是不同机械剪应力的机械生物信号感受器。在层流剪切应力刺激人脐静脉内皮细胞中检测到许多Klf的表达。 其中Klf4表达增加倍数最高，并显示层流剪切应力依赖性增加[35]。在血管平滑肌细胞中的研究表明机械拉伸改变Klf4蛋白表达[36]。在本实验运动结束24 h后运动组Smad7和Klf4表达较对照组略有上升趋势，但均未发生显著性变化，故二者对成骨的抑制作用不明显，也有利于骨形成，也与已有的骨微结构研究相符[12-13]。关于水平跑台应力刺激后不同时间内Smad7和Klf4表达变化趋势有待进一步研究。

4 结论

4.1 跑台训练后PBMCs中TGF-β/BMPs信号途径相关的基因Hes1、Gpnmb、Col1a1、 Mmp8、Mitf、Smad7和Klf4 mRNA表达与本实验强度运动利于骨质改善相符，且与骨密度及骨形态等指标比较，能够更灵敏反映运动对骨重塑的影响。提示上述基因有望成为反映运动对骨重塑影响的候选分子標记，但尚需进一步研究。

4.2 本研究对运动后PBMCs中TGF-β/BMPs信号途径相关的基因Hes1、Gpnmb、Col1a1、 Mmp8、Mitf、Smad7和Klf4的mRNA表达与骨重塑的关系进行首次报道，也为PBMCs作为研究运动影响骨重塑的组织取材提供TGF-β/BMPs信号途径的分子生物学依据，为研究运动后不同信号对骨重塑的调节提供参考资料。

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