贮藏期鸡蛋新鲜度指标与S-卵白蛋白含量的相关关系

付丹丹，王巧华,2,*，马美湖，许 锋

（1.华中农业大学工学院，湖北 武汉 430070；2.华中农业大学 国家蛋品加工技术研发分中心，湖北 武汉 430070；

3.华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070）

鸡蛋是人们日常生活中摄取蛋白质的重要来源之一，鸡蛋在贮藏过程中的品质变化是一个复杂的过程，包括蛋质量损失率的增加[1]、pH值的变化[2]等。卵白蛋白占蛋清总蛋白的54%～63%，是蛋清蛋白的主要组成成分[3]，贮存期间蛋清中S-卵白蛋白相对质量分数由新产蛋的5%上升至冷藏6 个月后的81%[4]；因此蛋清蛋白的变化与鸡蛋品质的关系是揭示鸡蛋品质变化规律的最本质因素。通过对蛋清S-卵白蛋白含量变化的研究可以了解鸡蛋品质变化的规律，其品质变化也可以通过S-卵白蛋白含量的改变得到很好的反映；同时，鸡蛋中S-卵白蛋白的形成不依赖于鸡龄、营养状况和蛋质量等因素，且显示出高的重复性与低的自然变异性，是评价鸡蛋品质的潜在方法[5]。因此有关鸡蛋贮藏期蛋白变化与品质关系的研究是蛋品加工基础研究和保鲜研究领域的一个重要方向。目前关于S-卵白蛋白含量的研究主要集中在其形成机理、凝胶特性等理化性质方面[6-9]，也有少量对鸡蛋pH值、温度、贮藏条件对S-卵白蛋白形成影响的研究[10-11]，但在鸡蛋品质对S-卵白蛋白含量形成影响方面的研究还不多见[12]；此外，有学者的研究表明高光谱、近红外光谱等无损检测的光谱信息与蛋清的哈夫值、酸碱度、黏度、蛋白质含量等有一定的相关性[13-15]。

本实验将贮藏期间的鸡蛋品质变化与S-卵白蛋白含量变化视为一个动态变化的系统，系统性地分析了鸡蛋品质与S-卵白蛋白含量的相关关系，并研究了各鸡蛋品质参数对S-卵白蛋白含量变化的影响程度，以期在不打破鸡蛋的情况下就可以从生化本质的角度揭示蛋品品质变化机制，建立无损快速的鸡蛋品质检测方法，实现蛋品品质的有效无损监控。并以S-卵白蛋白含量为自变量建立了等价蛋龄模型，为鸡蛋产业的贮藏保鲜提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

当日产的新鲜海兰褐壳鸡蛋共108 枚，购于湖北武汉九峰养鸡场。

NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4、NaCl、CH3COONa、CH3COOH、CuSO4·5H2O、C4O6H2KNa·4H2O等试剂均购于武汉百惠生物有限公司。

磷酸盐缓冲液：将6.85 g NaH2PO4·2H2O与21.55 g Na2HPO4溶解于500 mL去离子水中，备用。每次实验时取50 mL稀释20 倍，调节pH值至7.5。

沉淀剂：0.5 mol/L NaCl溶液和0.1 mol/L CH3COONa溶液以体积比1∶1混合，用CH3COOH溶液调节pH值至4.7。

双缩脲溶液：将3.6 g CuSO4·5H2O与7.2 g C4O6H2KNa·4H2O溶解于1 L的去离子水中，将72 g NaOH溶解于720 mL的去离子水中，在每次实验时以两者体积比为1∶1混合备用。

1.2 仪器与设备

SPX智能型生化培养箱 宁波江南仪器厂；SF2000电子数显卡尺 桂林广陆数字测控股份有限公司；JA2002电子天平 上海浦春计量仪器有限公司；MP511 pH计 上海三信仪表厂；HH-8集热式数显水浴锅国华电气有限公；D U 7 0 0紫外-可见分光光度计美国贝克曼库尔特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 实验设计

将所有鸡蛋放置于（22±1）℃、相对湿度65%的恒温恒湿培养箱中贮藏。每隔5 d随机取样，即贮藏第1、6、11、16、21、26、31、36、41天时，每次随机挑选出12 枚鸡蛋，依次编号，分别测定每枚鸡蛋的品质参数及卵白蛋白的含量。

1.3.2 鸡蛋品质参数的测定

1.3.2.1 哈夫值的测定

用电子天平分别称取每枚鸡蛋的质量（m/g），然后将其打破，手动测定鸡蛋哈夫值，用数显游标卡尺测定每枚鸡蛋浓蛋白的高度，每枚鸡蛋测3 次，并取其平均值作为每枚鸡蛋浓蛋白高度值（H/mm）。按照公式（1）计算鸡蛋的哈夫值[16]。

1.3.2.2 蛋黄指数的测定

利用数显游标卡尺测定每枚鸡蛋的蛋黄高度和蛋黄直径，每个鸡蛋测3 次，取其平均值作为鸡蛋最终的蛋黄高度（h/mm）和蛋黄直径（d/mm）。按照公式（2）计算鸡蛋的蛋黄指数[17]。

1.3.2.3 蛋清pH值的测定

利用分蛋器将蛋清蛋黄分离，校准pH计，测定每个鸡蛋蛋清的pH值，每个鸡蛋测3次，取其平均值作为鸡蛋最终的pH值。

1.3.2.4 卵白蛋白含量的测定

将用蛋清分离器分离出来的每枚鸡蛋的蛋清分别置于1～12号100 mL小烧杯中，并分别在4 ℃条件下用磁力搅拌器搅拌均匀；用分析天平分别量取（5.00±0.05）g的蛋清至13～24号100 mL小烧杯中；并用70 mL量筒分别量取25 mL pH 7.5的磷酸盐缓冲液加入到每个小烧杯中，磁力搅拌5 min；用1 mL移液枪分别移取5 mL的混合溶液于2 支20 mL的玻璃密闭试管中（分别标记为iA、iB，i为鸡蛋编号）；将iA号试管同时放置于75 ℃的水浴锅中水浴加热30 min后冷却；向iA、iB试管中分别加入5 mL沉淀剂，混合倾倒于离心管中，并再分别向每个试管中加入5 mL沉淀剂冲洗试管内壁，尽量将试管中的液体转入相应的离心管中。混匀离心管中的溶液，静置10 min后，12 000 r/min离心5 min，分别从每个离心管上部用移液枪移取2 mL上清液至10 mL离心管中，向每个10 mL离心管中分别加入4 mL双缩脲溶液，室温下静置30 min；用紫外-可见分光光度计测定每个样品在540 nm波长处的吸光度（A），对照样为2 mL去离子水与4 mL双缩脲溶液混合液。按照式（3）计算S-卵白蛋白含量[18]。

1.3.2.5 灰色关联度分析

灰色关联分析是对一个系统发展变化态势的定量分析的方法，是一种多因素统计分析法，它通过确定参考数列和多个比较数列的几何形状相似程度来判断其联系的紧密性，能够反映曲线间的关联程度，这与Pearson相关性分析有所不同，Pearson相关性分析仅是对变量之间的线性相关程度进行分析[19-21]，且相关性不等于因果性。灰色关联分析的基本步骤如下：1）建立反应系统行为特征的参考数列x0（式（4））；2）建立影响系统行为的比较数列xi（式（5））；3）求初值化变换矩阵xi′（式（6））；4）求差序列Δi（k）（式（7））；5）计算关联系数ξi（k）（式（8））；6）计算关联度ζi（式（9））并排序。

式（8）中：Φ为分辨系数，其作用在于提高关联系数间的差异显著性，Φ∈（0，1），一般取Φ＝0.5。关联系数是参考数列和比较数列在各时期的关联程度值。

关联度是参考数列和比较数列在整个时段中的平均关联程度值。关联度越大，说明该比较数列对参考数列的影响越大，反之，则影响越小[22]。在计算完关联度后对所有获得的关联度进行排序，通过比较关联度，就可以获得多个因素对参考数列的影响程度，从而找出影响参考变量的主次因素[23]。

1.4 数据处理

通过MATLAB 2014a软件对实验获得的数据进行灰色关联度分析。利用SPSS 12.0软件中的Pearson相关性检验进行相关关系研究，并利用One-way ANOVA中的LSD比较法进行显著性分析。

2 结果与分析

业内没有根据S-卵白蛋白含量对鸡蛋分类的标准，国际上建立了通用的鸡蛋哈夫值的分类标准，因此根据实验获得的数据，以S-卵白蛋白含量为因变量（x）、哈夫值为自变量（y）建立两者之间的指数回归关系（式（10））。

y=4.367 8×e-0.0294x（R=0.912 9） （10）

依据鸡蛋哈夫值分类的标准[24]，将x＝72、60分别带入上式中，得y＝53%、75%，因此将S-卵白蛋白含量分为3 类：y＜53%、53%＜y＜75%、y＞75%。各鸡蛋品质参数与S-卵白蛋白含量之间的相关关系见表1。

表 1 S-卵白蛋白含量与各鸡蛋品质参数的相关系数Table 1 Correlation coef ficients between S-ovalbumin content and egg quality parameters

2.1 鸡蛋新鲜度品质指标与S-卵白蛋白含量的相关性

2.1.1 哈夫值与S-卵白蛋白含量的相关性

鸡蛋新鲜度对贮藏期间蛋清S-卵白蛋白含量的影响见图1。不同S-卵白蛋白含量的鸡蛋之间的新鲜度差异极显著（P＜0.01），并且随着S-卵白蛋白含量的增加，鸡蛋哈夫值逐渐减小。鸡蛋哈夫值大小与蛋清S-卵白蛋白含量存在极显著的负相关关系（R＝-0.913，P＜0.01）。由哈夫值的定义，其值由蛋质量和浓蛋白高度决定，由表1可以看出，蛋质量与S-卵白蛋白含量尽管也存在负相关性（R＝-0.367，P＜0.01），但是其线性相关程度比浓蛋白高度与S-卵白蛋白含量的线性相关程度（R＝-0.905，P＜0.01）要低得多，这与Masaaki[5]报道的S-卵白蛋白的形成不依赖于蛋质量相一致。因此鸡蛋哈夫值对S-卵白蛋白含量的影响主要源于浓蛋白高度对S-卵白蛋白含量的影响，其原因可能是卵白蛋白中的巯基对浓蛋白高度的变化起到作用[7]。

图 1 不同S-卵白蛋白含量下的哈夫值Fig. 1 Haugh unit at different S-ovalbumin contents

2.1.2 蛋黄指数与S-卵白蛋白含量的相关性

图 2 不同S-卵白蛋白含量下的蛋黄指数Fig. 2 Egg yolk index at different S-ovalbumin contents

由表1可知，蛋黄指数与S-卵白蛋白含量呈极显著负相关关系（R＝-0.900，P＜0.01），即蛋黄指数与S-卵白蛋白含量的线性相关程度高，S-卵白蛋白含量越高，蛋黄指数越小。由图2可知，不同S-卵白蛋白含量鸡蛋的蛋黄指数存在极显著差异（P＜0.01），且随着S-卵白蛋白含量的增加，蛋黄指数呈下降趋势。此外，蛋黄指数与哈夫值存在极显著的正相关关系（R＝0.901，P＜0.01），与pH值存在极显著的负相关关系（R＝-0.636，P＜0.01）。

2.1.3 蛋清pH值与S-卵白蛋白含量的相关性

温度和pH值是蛋清N-卵白蛋白转化为S-卵白蛋白的主要因素[25]，由表1可知，蛋清pH值与S-卵白蛋白含量呈极显著正相关关系（R＝0.648，P＜0.01），其相关程度没有哈夫值与蛋黄指数的相关性高。由图3可知，不同S-卵白蛋白含量下的蛋清pH值差异极显著（P＜0.01），且随着S-卵白蛋白含量的增加，pH值先增大后减小。此外，pH值与哈夫值呈极显著负相关关系（R＝-0.700，P＜0.01）；pH值与蛋质量无显著相关关系（R＝0.053，P＞0.05）；pH值与蛋黄指数呈极显著负相关关系（R＝-0.636，P＜0.01），与蛋黄直径呈极显著正相关关系（R＝0.612，P＜0.01），与蛋黄高度呈极显著负相关关系（R＝-0.553，P＜0.01）。

图 3 不同S-卵白蛋白含量下的pH值Fig. 3 pH at different S-ovalbumin contents

2.2 鸡蛋新鲜度指标与S-卵白蛋白含量的灰色关联度分析

运用灰色关联度分析法，将贮藏期间鸡蛋品质变化与S-卵白蛋白含量的变化视为一个动态变化的系统，通过计算和分析鸡蛋哈夫值、蛋黄指数、pH值等多因素与S-卵白蛋白含量之间的灰色关联度及其大小次序，确定出影响S-卵白蛋白含量的主要因素，继而得出鸡蛋品质多因素与S-卵白蛋白含量之间关系的定量化分析结果。由于各鸡蛋品质因素的量纲不同，不同量纲的因素之间难以比较；因此在进行灰色关联度分析之前，采用均一化的方法对各品质指标进行无量纲处理[26]，其计算公式如式（11）所示。

式中：Mij’为第i行第j列的一个数值的无量纲值；Mij为第i行第j列的一个数值；Mj为第j列的平均值。

图 4 贮藏期间无量纲化后的鸡蛋新鲜度指标及S-卵白蛋白含量的变化规律Fig. 4 Variation in non-dimensionalized egg freshness indexes and S-ovalbumin content

由图4可知，S-卵白蛋白含量随着贮藏时间的延长逐渐增加，哈夫值和蛋黄指数随着贮藏时间的延长逐渐减小，pH值随着贮藏时间的延长先增加后减小。

选取S-卵白蛋白含量作为参考序列，各鸡蛋品质指标作为比较数列。依据灰色关联度的计算步骤，计算鸡蛋品质因素与S-卵白蛋白含量的综合灰色关联度见表2。不同贮藏时间的鸡蛋新鲜度指标与S-卵白蛋白含量的相对灰色关联度变化趋势如图5所示。

表 2 鸡新鲜度指标与S-卵白蛋白含量的综合灰色关联度Table 2 Comprehensive gray correlation degree between egg freshness indexes and S-ovalbumin content

图 5 贮藏期间鸡蛋新鲜度指标与S-卵白蛋白含量的灰色关联度变化趋势Fig. 5 Variation in gray correlation degree between egg freshness indexes and S-ovalbumin content during storage

由表2可知，贮期各新鲜度指标值对S-卵白蛋白含量的综合灰色关联度排序为：pH值＞蛋黄指数＞哈夫值。一般情况下，灰色关联度在0.8以上，则认为参考数列与比较数列曲线间的关联程度高，灰色关联度在0.3～0.8之间，则可认为曲线间有弱的关联性，灰色关联度小于0.3，则认为曲线间没有关联性。

由图5可知，贮藏期间鸡蛋新鲜度指标与S-卵白蛋白含量的灰色关联度在不断变化，在贮藏第21天时，哈夫值和蛋黄指数与S-卵白蛋白含量的关联度达到最高，约为0.9；pH值在贮藏第26天时与S-卵白蛋白含量的灰色关联度达到最高，大于0.9。关联程度越高，曲线同步变化程度越高。

综上，每个品质因素与S-卵白蛋白含量的综合灰色关联度均大于0.6（表2），说明每个品质因素都对S-卵白蛋白含量有影响，其中pH值的影响最大，与S-卵白蛋白含量的同步变化程度最高，在各鸡蛋品质影响因素中，是影响S-卵白蛋白含量变化的主导因素，本研究结论与Omana等[27]研究得出的S-卵白蛋白的增加可能是由于蛋清pH值增加的结论相吻合。

2.3 等价蛋龄预测模型

鸡蛋不仅含有大量的优质蛋白，而且价格低廉，是消费者日常生活中的必备品，其新鲜度对消费者的食品安全有着重要的影响，有关贮藏期间鸡蛋品质的评价和预测及其与贮藏时间的关系也一直是食品加工和保鲜领域的研究热点，而蛋龄（即鸡蛋贮藏的时间）并不能准确反映不同贮藏条件下鸡蛋的真实鲜度[29-30]；因此，有学者提出利用等价蛋龄来估算不同贮藏条件下的鸡蛋新鲜度[28]。对在22 ℃条件下贮藏的鸡蛋蛋清中的S-卵白蛋白含量与贮藏时间之间进行Pearson相关性分析，结果表明S-卵白蛋白含量与贮藏时间呈极显著相关（R＝0.992，P＜0.01）。本研究选取22 ℃、相对湿度65%的贮藏条件下获取的S-卵白蛋白含量建立等价蛋龄的预测模型，用于评价货架期不同贮藏条件下商业鸡蛋的新鲜度。

图 6 鸡蛋等价蛋龄预测模型Fig. 6 Prediction model of equivalent egg age

以S-卵白蛋白含量为自变量，通过二次多项式回归模型建立鸡蛋等价蛋龄预测模型，如图6所示，预测方程为：y＝0.001 03 x2+0.409x－8.260 3；其中y为鸡蛋等价蛋龄，x为S-卵白蛋白含量。预测值与实测值的决定系数R2＝0.986 81，P＜0.01。由此可见，建立的等价蛋龄模型可靠性高，预测性比黄群等[10]等建立的指数回归预测模型准确性更高。

3 结 论

鸡蛋哈夫值与S-卵白蛋白含量之间存在极显著负相关关系（R＝-0.913，P＜0.01），蛋黄指数与S-卵白蛋白含量之间存在极显著负相关关系（R＝-0.900，P＜0.01），pH值与S-卵白蛋白含量间存在极显著正相关关系（R＝0.648，P＜0.01）。

蛋质量与S-卵白蛋白含量尽管也存在极显著负相关性（R＝-0.367，P＜0.01），但是其线性相关程度比浓蛋白高度与S-卵白蛋白含量的线性相关程度（R＝-0.905，P＜0.01）要低得多。

各品质因素与S-卵白蛋白含量的灰色关联度均大于0.6，哈夫值、蛋黄指数及pH值对S-卵白蛋白含量的综合关联度排序为：pH值（灰色关联度为0.742）＞蛋黄指数（灰色关联度为0.663）＞哈夫值（灰色关联度为0.646），pH值是影响S-卵白蛋白含量变化的主导因素。

在22 ℃贮藏条件下，S-卵白蛋白含量与贮藏时间呈极显著正相关（R＝0.992，P＜0.01）。以S-卵白蛋白含量为自变量，通过二次多项式回归模型建立鸡蛋等价蛋龄预测模型，其决定系数R2＝0.986 81，P＜0.01，可靠性高。