10种中草药抗氧化活性的比较研究

魏东伟，周亚萍，朱世杰，任园宇，刘 艺

（河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 450002）

我国是中草药的发源地，也是中药材生产和使用大国。大部分中草药来源于天然药物及其后处理产品，主要由植物的根、茎、叶、果，动物的皮、骨、器官、内脏和矿物质构成。许多学者认为，大多数中草药的功效与自身的抗氧化作用密切相关，抗氧化活性越强，中草药相关功效体现地越为显著［1］。已有研究表明，中草药的抗氧化活性与总酚含量密切相关，总酚含量越高抗氧化活性越强［2-3］。酚类物质是植物体内存在的一大类次生代谢产物，酚类化合物分子结构中含有多个酚羟基，是非常好的氢或电子供体，在植物体内由磷酸戊糖途径、莽草酸合成途径和苯基丙酸类合成途径生成。酚羟基特别是邻位酚羟基容易被氧化为醌类结构，消耗组织中的氧，阻止或减缓自动氧化链式反应，从而实现其抗氧化功能［4-6］。

基于此，本研究以市售虎杖、黄芩、夏枯草、女贞子、黄花蒿、续断、苦参、白芍、莪术和姜黄为研究对象，蒸馏水为提取溶剂，比较研究10种中草药的抗氧化活性。其中，黄芩（唇形科）、虎杖（蓼科）、续断（川续断科）、白芍（毛茛科）、莪术（姜科）、姜黄（姜科）、苦参（豆科）均来自于植物的根茎部分；夏枯草来自于唇形科夏枯草的果穗；女贞子采用木犀科植物女贞的果实；黄花蒿则是菊科植物黄花蒿的地上干燥部分。药典记载，虎杖药性微寒，具有清热解毒、散瘀止痛的功效，用于跌打损伤、肺热咳嗽。黄芩药性寒，具有清热燥湿、泻火解毒功效，用于湿温、暑湿，肺热咳嗽。夏枯草药性寒，能够清肝泻火，可用于目赤肿痛、目珠夜痛。女贞子药性凉，能够滋补肝肾，明目乌发，用于肝肾阴虚、眩晕耳鸣、内热消渴。续断药性微温，能够补肝肾，强筋骨，多用于肝肾不足、腰膝酸软。黄花蒿药性寒，可清虛热，解暑热，用于夜热早凉、阴虚发热、暑邪发热。苦参药性寒，能够清热燥湿，用于便血黄疸、湿疹、湿疮。白芍药性寒，能够养血调经，平抑肝阳，用于月经不调、头痛眩晕。莪术药性温，能够行气破血，消积止痛，用于淤血经闭、食积胀痛。姜黄药性温，能够破血行气，通经止痛，用于胸搏心痛、痛经经闭、风湿肩臂疼痛［7］。由于不同测定方法所依据的原理不同，为了更准确地测定所选中草药的抗氧化能力，本试验采用DPPH自由基清除法、FRAP铁离子还原法及FC福林酚比色法，测定其水提物清除自由基能力、总的抗氧化能力以及总多酚含量，综合研究10种中草药的抗氧化活性，为进一步研究和开发中草药等天然抗氧化剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的中草药为虎杖（Polygonum Cuspidatum Sieb）、 黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）、夏枯草（Prunella vulgarisL）、女贞子（Ligustrum lucidum Ait）、 黄花蒿（Artemisia annua L）、续断（Dipsacus asper Wall）、 苦参（Sophora flavescens Ait）、白芍（Paeonia lactif l ora Pall）、莪术（Curcuma phaeocaulis Val）和姜黄（Curcuma longa），于2017年7月购自张仲景大药房。经65℃烘干，粉碎后过孔径为0.45 mm分样筛，置于干燥箱中备用［7］。

试剂：2,2-二苯基-1-古肼基自由基（DPPH）、福林酚（Folin-Ciocalteu）、没食子酸（C7H6O5）、七水合硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）、无水乙醇（C2H6O）、无水醋酸钠（CH3COONa）、无水碳酸钠（Na2CO3）、冰醋酸（CH3COOH）、浓盐酸（HCl）、三吡啶三吖嗪（TPTZ）、六水合氯化铁（FeCl3·6H2O）均为分析纯级试剂。

1.2 仪器设备

UV-2550紫外-可见光分光光度计，日本SHIMADZU公司；D-78532台式高速冷冻离心机，德国HETTICH 公司；电子天平BS124S，赛多利斯科学仪器北京有限公司；电热恒温水浴锅DKS22，上海精宏实验仪器设备有限公司；组织捣碎机MODEL800S，上海凌初环保仪器有限公司；烘箱HPX-9082 MBE，上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 样品液的制备

精确称取0.05 g中草药试样于10 mL离心管，加8 mL蒸馏水，90℃恒温加热15 min，冷却至室温后5 000 r/min离心10 min，取上清液至10 mL离心管备用，得浓度6.25 g/L的中草药提取液。

1.4 抗氧化活性的测定

1.4.1 DPPH自由基清除法 自由基清除反应体系：称取0.00528 g DPPH，加入无水乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶，得0.1339 mmol/L DPPH乙醇溶液，4℃保存备用。移取各中草药上清液0.2 mL于10 mL离心管，分别加入0.1339 mmol/L DPPH乙醇溶液4 mL，混合均匀，于37℃恒温反应20 min，用分光光度计测定其510 nm处的吸光值［8-11］。以4 mL DPPH与0.2 mL去离子水的混合溶液为空白对照，加样方法见表1。

式中，A0为样品空白时溶液吸光值；AX为含有样品提取物时溶液吸光值；A0’为样品提取物本底吸光值。

表1 DPPH 自由基反应体系（mL）

1.4.2 总多酚含量的测定 标准曲线的建立：称取2 mg没食子酸，蒸馏水定容至10 mL得0.2 mg/mL没食子酸溶液，使用时稀释为20 µg/mL的标准溶液。分别取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL没食子酸标准溶液于25 mL容量瓶，加入0.413 g/mL福林酚试剂0.4 mL，振荡混匀后加入0.8 mL 12%碳酸钠溶液并定容至25 mL，于55℃恒温反应10 min，用分光光度计测定其765 nm处的吸光度。以没食子酸浓度（µg/mL）为横坐标，吸光度值为纵坐标，得没食子酸的标准曲线。

样品检测：按照1.3配制方法制备各中草药水提液，各取1 mL于25 mL容量瓶中，依据上述标准曲线测定方法测定样品总多酚含量。总酚含量按照没食子酸标准曲线换算成没食子酸当量表示。

1.4.3 总抗氧化能力的测定 FRAP工作液的制备：将pH3.6的300 mmol/L NaAC-HAc缓冲液、20 mmol/L FeCl3溶液和10 mmol/L TPTZ盐酸溶液，按10∶1∶1体积比配制成FRAP工作液，备用。标准曲线的建立：分别取浓度0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mmol/L FeSO4各 100 µL，加入到3 mL FRAP工作液的离心管，充分混匀后37℃恒温反应10 min，用分光光度计测定其在593 nm处吸光值，制作标准曲线［12］。

样品检测：按照1.3配制方法制备各中草药水提液，按照上述标准曲线测定方法测定中草药的FRAP值。总抗氧化能力按照FeSO4标准曲线换算成FeSO4当量（mmol/L）表示。

2 结果与分析

2.1 DPPH自由基清除能力

DPPH法因其操作简便、灵敏、稳定性好的特点，已被广泛应用于定量测定自由基的清除能力，通常以抑制率IR或半抑制浓度IC50（清除率为50%时所需抗氧化剂的浓度）为衡量指标来表示一种物质的抗氧化活性。本实验采用抑制率来表示，抑制率IR值越大，表明测定对象的抗氧化活性越强，反之，则抗氧化活性较弱［8-10］。

各中草药试样自身紫外-可见吸光光谱如图1所示，200～400 nm处有明显的吸收峰，说明中草药水提液含有酚类等次生代谢物质［13］。而510 nm后均没有出现任何吸收峰，说明中草药水提液自身不会对所选定的DPPH法（510 nm）、FC福林酚法（765 nm）、FRAP法（593 nm）产生干扰。以波长为横坐标，吸光度为纵坐标绘制各中草药试样的DPPH反应体系曲线，由图2可知，在510 nm处中草药试样DPPH反应体系具有最大吸收峰，不同试样峰值越低，自由基清除率越高。

图1 10种中草药水提液（0.3 g/L）的紫外-可见吸收光谱

图2 10中草药水提液DPPH反应体系的紫外-可见吸收光谱

图3 没食子酸在FC体系的紫外-可见吸收光谱（A）及相应的标准曲线（B）

2.2 总多酚含量

经多次试验得出，当福林酚试剂与12%的碳酸钠溶液体积比为1∶2、反应温度55℃、反应时间10 min时，酚类化合物的浓度与吸光度呈现良好的相关性，线性关系较好。以波长为横坐标，没食子酸溶液吸光度为纵坐标作标准曲线，结果（图3）显示，在765 nm处没食子酸具有最大吸收峰。线性关系为Y=0.02223X+0.06775，R=0.99315（n=7），在浓度0～12 µg/mL范围内线性关系良好。式中，Y为反应液的吸光度，X为没食子酸标准液浓度（µg/mL）。

2.3 总抗氧化能力FRAP值

FRAP法易于操作、反应快速、重复性好，是目前食品和医药领域测定样品抗氧化能力的常用方法之一，通常以FRAP值即FeSO4当量来表示样品溶液总抗氧化活性的大小。以波长为横坐标，吸光度为纵坐标绘制FeSO4标准曲线如图4所示，得标准曲线回归方程：Y=0.0668+0.70875X，R=0.99889（n=5），在0～4 mmol/L范围内与吸光值线性良好。从各中草药试样的FRAP反应体系紫外-可见吸收光谱（图5），可知，在593 nm处具有最大吸收峰，试样峰值越高，抗氧化能力越强。

采用DPPH自由基清除法，FC福林酚法和FRAP法测定10种中草药水提液的抗氧化活性结果见表2。从表2可以看出，10种中草药水提液对DPPH自由基均有一定的清除力，其中虎杖、黄芩、夏枯草、女贞子的自由基清除率均超过70%，抗氧化活性较强；而姜黄、莪术、白芍、苦参、续断、黄花蒿的自由基清除力在50%以下，抗氧化活性相对较弱。10种中草药的自由基清除力依次为：虎杖＞黄芩＞夏枯草＞女贞子＞黄花蒿＞续断＞苦参＞白芍＞莪术＞姜黄。

图4 不同浓度FeSO4在FRAP体系的紫外-可见吸收光谱（A）及相应标准曲线（B）

FC法检测结果通过回归方程计算可知，虎杖、女贞子、夏枯草、黄芩的没食子酸当量超过2.8 µg/mL，表现出较强的抗氧化能力，说明4种中药的总多酚含量较高。所选中草药总多酚含量由高到低依次为：虎杖＞女贞子＞夏枯草＞黄芩＞黄花蒿＞莪术＞续断＞白芍＞姜黄＞苦参。

图5 10种中草药FRAP反应体系的紫外-可见吸收光谱

FRAP铁离子还原法检测结果显示，黄芩、夏枯草、女贞子、虎杖的FRAP值都大于1.8 mmol/L，表现出较强的抗氧化能力，其他中草药的FRAP值均小于1.2 mmol/L，抗氧化能力较弱。10种中草药总抗氧化能力依次为：黄芩＞夏枯草＞女贞子＞虎杖＞黄花蒿＞续断＞莪术＞白芍＞姜黄＞苦参。

表2 10种中草药抗氧化活性的测定结果

2.4 相关性分析

为进一步了解中草药水提液抗氧化活性测定方法间的关联，对所选DPPH自由基清除法、FC福林酚比色法与FRAP铁离子还原法间进行相关性分析。以FRAP铁离子还原法与DPPH自由基清除法相关性分析为例说明：以中草药水提液的硫酸亚铁当量（X）为自变量，自由基清除率（Y）为因变量进行相关性分析，得回归方程的相关系数R。同样的方法可获得FRAP与FC福林酚比色法、FC与DPPH自由基清除法间的相关性。

由图6可知，3种方法间均呈显著正相关，其中中草药水提液的硫酸亚铁当量与DPPH自由基清除率相关系数为0.926，与没食子酸当量的相关系数为0.688；中草药水提液的没食子酸当量与DPPH自由基清除能力的相关系数为0.822。FC福林酚比色法与FRAP铁离子还原法、DPPH自由基清除法间的相关系数R＞0.688，具有较高的相关性，说明可以用福林酚比色法粗略地衡量中草药水提液的总抗氧化能力和自由基清除能力。FRAP法、DPPH法和FC3种方法检测结果间均呈显著正相关，进一步证实多酚类次生代谢产物是所选中草药自由基清除能力及抗氧化能力的重要作用因素［14-15］。

图6 中草药水提液抗氧化活性DPPH、FRAP与FC法间的相关性分析

3 结论与讨论

本试验以常见的10种中草药为研究对象，水为提取溶剂，比较研究其总抗氧化能力、自由基清除能力及总多酚的含量。结果显示，虎杖、黄芩、夏枯草和女贞子的总抗氧化能力FeSO4当量均大于1.8 mmol/L，自由基清除率超过70%，总酚量均大于2.8 µg/mL，抗氧化能力相对较强；黄花蒿、续断、苦参、白芍、莪术和姜黄的总抗氧化能力FeSO4当量小于1.2 mmol/L，自由基清除率低于50%，总酚含量低于2.3 µg/mL，具有一定的抗氧化能力，但作用较弱。

黄芩、虎杖、夏枯草、女贞在3种方法中均显示出较强的抗氧化活性，4种中药均属药性寒凉的清热解毒类中药，有清热燥湿兼清热泻火等功效，按“热者寒之”的中医治法，主要用于热证，治疗外感或内伤的湿热火毒，可推断中药的抗氧化性可能与其清热功效有关，与前人关于清热解毒类中药抗氧化活性的研究结果一致［16］，而发挥药性的具体活性成分有待进一步研究，其药用价值和保健功能值得关注。

相关性分析结果显示，FRAP法、DPPH法和FC3种方法测定结果虽大致相同，但总体抗氧化顺序并不完全一致，可能与不同中草药提取液成分与各种反应体系间复杂的协同作用有关［7］。同时，3种方法抗氧化能力结果间均呈显著正相关，可能是由于各种评价方法机理不同导致同一样品在不同评价体系里可能表现出不同的抗氧化活性，因而在进行抗氧化剂筛选时采用多种方法并进行综合评价是非常必要的。