草鱼鱼种细菌性败血症病原的分离与鉴定

■ 陈昌福 曹丽敏 陈辉 方苹

（1 华中农业大学，武汉 430070；2 沈阳元丰饲料有限公司，沈阳 110202；3 江苏省渔业技术推广中心，南京 210029 ）

今年5月初，辽宁省沈阳市辽中区的养殖草鱼（Ctenopharyngodon idellus）出现大范围疾病流行，而且死亡率比较高。患病草鱼出现比较典型的细菌性败血症的症状，主要特征是身体发黑、部分鳞片松动、脱落，鳍条基部有出血现象，部分病鱼的肛门红肿，鳃上有大量黏液并且附有污泥。解剖病鱼检查，可见腹腔内有腹水，肠道内少有食物，肠道发红、肠道内有充气的现象。

对具有上述症状的病鱼，利用微生物学操作技术，从和患病鱼体的肾脏和肝胰脏中进行了致病菌的分离和鉴定。现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 患病鱼的来源与规格

用于分离致病菌的患病鱼，主要取自辽宁省沈阳市辽中区刘二堡镇及其周边水产养殖区域内成鱼养殖池塘。患病草鱼规格大多为100.0～200.0g的二龄草鱼鱼种，也有部分体重约为1,000.0g的大规格草鱼。

1.2 致病菌株分离与纯化

从养殖池塘中捞取鱼体发黑、离群独游于池塘边上的患病草鱼，将活体带回实验室。在无菌条件下解剖鱼体后，从其肾脏和肝胰脏中取样，接种在盛有BHIA（Diffco）培养皿中。将接种好的培养皿，置于25℃恒温培养箱中培养48h后，从培养皿中挑取单个菌落，转接于BHIA培养皿中，进行纯化培养48h。

1.3 接种活菌与菌株再分离

从分离纯化的多个菌株中，随机取14个优势菌株接种在BHIA（Diffco）培养皿中，在25℃恒温培养箱中纯培养48h后，用灭菌生理盐水洗下培养皿中的菌落，将其菌体浓度调节成107cells/mL活菌液。对平均体重约100.0g的正常小草鱼，经胸鳍基部对每尾注射0.2mL菌液后，将其放回水族箱中继续饲养观察。待供试鱼出现与自然条件下相似的细菌性败血症症状后，捞取具有典型疾病症状的患病鱼体，在无菌条件下从其肾脏和肝胰脏中再次分离菌株。将这些再分离菌株与初分离并用于接种供试鱼的菌株，通过分子生物学和理化特性鉴定的方法，鉴定其菌株的种属。

表1 分离菌株人工感染草鱼后的发病、死亡时间与死亡率

1.4 菌株的鉴定

1.4.1 根据菌株的16S rDNA鉴定

将初次分离的14个菌株和再分离的10个菌株纯化培养后，寄送给生工生物工程（上海）股份有限公司，委托其检测菌株的16S rDNA。

1.5 根据菌株的理化特性鉴定

按照《细菌鉴定手册》（第八版）和《常见细菌系统鉴定手册》的鉴定参数，分别对初次分离的14个菌株和再分离的10个菌株，进行了理化特性鉴定[1,2]。

2 结果

2.1 接种活菌后供试鱼发病情况

对平均体重约为100.0g的正常小草鱼经胸鳍基部注射0.15～0.2mL活菌液后，供试鱼发病情况如表1中所示。由表1所示结果可以看出，经过接种不同菌株活菌液后，供试鱼出现细菌性败血症的情况和死亡数量是有所不同的，显示出了菌株的毒力存在差异。

2.2 菌株的种属

将初次分离和再次从患病鱼体中分离的部分致病菌株，进行分子生物学和理化特性鉴定结果如表2所示。由表2所示结果可以看出，检测菌株的16S rDNA的分子生物学和理化特性鉴定结果是完全一致的。初次分离的14个菌株中有12个菌株是属于A.hydrophila，只有2株是属于A.sobria。而从人工致病的鱼体中再次分离到的10个菌株，则均属于A.hydrophila。

表2 从患病草鱼体内初分离和再次分离菌株的鉴定

3 讨论

淡水鱼类细菌性败血症主要是由气单胞菌属（Aeromonas）的几种细菌引起。本研究的结果证实，从辽宁省辽中养殖区域患细菌性败血症草鱼体内分离的大部分能菌株，均属于A.hydrophila，只有少数的属于A. sobria。

淡水鱼类细菌性败血症具有发病急、死亡率高的特点，一旦疾病暴发性地流行起来，要有效地控制疾病损失就比较困难了。迄今为止，对于养殖鱼类细菌病的防控主要有两条途径，即免疫防控与药物防控。农业农村部虽然已经批准了一种嗜水气单胞菌的灭活疫苗[3]。但是，因为各种原因这种疫苗至今为止应用范围尚不广泛。

我国虽然有几种允许用于细菌性疾病治疗的抗菌素类渔药。但是，由于长期以来没有对水产养殖动物致病菌药物敏感性监测数据，导致在采用药物治疗水生动物疾病时，难以做到科学、精准使用这些药物，药物治疗水生动物疾病的效果也就很难期待[4]。

本研究正是有鉴于上述问题存在，通过对分离菌株进行药物敏感性测定，为药物治疗鱼类这种细菌性疾病筛选合适药物和确定用药剂量。此外，还将通过研究这些菌株免疫原性和抗原性差异，从中筛选制备“自家疫苗”的菌株，研制能用于辽宁省辽中养殖区域的“自家疫苗”，进行对该养殖区内养殖草鱼细菌性败血症的免疫防控[5]。

（参考文献略）