骨骼DNA快速检验方法

陈国林，王学为，李 芳

（丽水市公安局刑侦支队，浙江 丽水 323000）

骨骼是DNA检验的一类特殊生物检材，其具有致密组织结构，DNA降解速度相对人体其他组织慢。对于高度腐败和白骨化的尸体案件，骨骼是DNA检验的首选检材，但是由于其特殊的组织结构及环境因素影响，骨骼DNA的提取较为困难。骨骼DNA鉴定的难点在于DNA拷贝低、有外源性DNA污染等[1]，因此保证充足的DNA模板量和避免外源性DNA污染是骨骼DNA检验成功的关键。

本文尝试应用ABI公司的PrepFiler BTA Forensic DNA试剂盒提取骨骼DNA，结合Global filerTMExpress试剂盒进行STR分型检验，在4.5 h内获得理想的分型结果。

1 材料与方法

1.1 检材来源

检材来源于本机构日常检案收取的自然灾害和分尸案中的骨骼样本，共计37份。按人体部位分为颅骨5例，胸骨2例，椎骨8例，掌骨7例，跖骨4例，髌骨5例，股骨4例，胫骨2例；按尸体埋藏时间分为1～2周3例，2～3周5例，3～4周6 例，4～5周11例，5～6周4例，6～7周1例，7～8周1例，28～29周4例，41～43周2例。

1.2 方法

1.2.1 样本预处理

用纯水冲洗干净骨骼表面，放通风柜中干燥后，用75%酒精清洗，再晾干。之后，用手术刀片将骨骼表面附着物刮干净，再用手术刀片切取或用压碎机压碎骨骼，取骨密质或骨松质骨碎片约15～100 mg。取样时首选骨松质，因其比骨密质所含细胞量多，故DNA含量相对较多[2]，且骨松质结构相对疏松，较易处理[3]。

1.2.2 DNA提取

将骨碎片置于1.5 mL离心管中，采用优化的PrepFiler®BTA Forensic DNA试剂盒（ABI公司，美国）提取，步骤如下：1) 加入PrepFiler BTA Lysis Buffer 220 μL，Proteinase K（ABI公司，美国）10 ～20 μL，DTT 溶液（1 mol/ L）3 μL ；震荡10 s，1000 r/min离心3 s后，将样本管放在恒温震荡金属浴孵育，56 ℃孵育1 h。2) 将样品管用离心机10 000 r/min离心90 s，将上清液转移到新的1.5 mL离心管中，注意不要吸到沉积物，如果转移的上清液过少，需添加PrepFile BTA Lysis Buffer至总体积180 μL。3) 在离心管中加入300 μL PrepFiler Lysis Buffer、15 μL 磁珠、300 μL异丙醇（99.5%分子级），震荡10 s以上，在室温中静置10～20 min。4) 震荡样本管10 s，离心3 s，将样本管放置在磁力架（ABI公司，美国）上静置3 min，去除上清液，注意不要碰触磁珠（下同）；加入600 μL PrepFiler Wash Buffer A洗涤液，从磁力架上取下样本管震荡10 s，离心3 s，将样本管放置在磁力架上静置1 min，去除洗涤液；再次加入300 μL PrepFiler Wash Buffer A洗涤液，重复上面的清洗步骤。5) 加入300 μL PrepFiler Wash Buffer B洗涤液，震荡10 s，离心3 s，将样本管放置在磁力架上静置1 min，去除洗涤液；继续在磁力架上晾干5 min。6)洗脱DNA：在管中加入20 μL的PrepFiler®Elution Buffer，震荡至磁珠重悬，将离心管放置在金属浴中70 ℃孵育10 min，最大速度震荡离心管直到磁珠重悬再离心5 s，将离心管放置到磁力架上静置3 min，直到磁珠稳定，小心将所有的液体转移到新的1.5 mL离心管中备用。

1.3 PCR扩增与检测

使用Global filerTMExpress试剂盒（ABI公司,美国）进行PCR扩增，反应体系10 μL，其中DNA模板溶液1 μL，PCR 反应混合液9 μL（含有Master mix additive的Master Mix 4μL，Primer Mix 4 μL，纯水1 μL）。采用9700型扩增仪（ABI公司, 美国），参照试剂盒扩增条件进行扩增。采用3130xL型基因分析仪（ABI公司，美国）检测扩增产物，应用GeneMapper ID-X v1.4软件进行STR分型。

2 结果

37份骨骼样本均获得了Global filerTMExpress扩增试剂盒中21个常染色体STR基因座和Amel基因座的分型结果，其中的13份男性骨骼样本也获得了试剂盒中2个Y染色体基因座的分型结果，各等位基因峰为200 ～ 7500 rfu，峰型较均衡，未见明显非特异性峰型（图1）。不同部位和不同埋藏时间骨骼样本的STR分型检验成功率均为100%。

图1 1例埋藏7～8周的胫骨STR分型图谱（Global filerT M Express扩增试剂盒）Fig.1 STR genotyping pro file by Global filerT M Express to test one shinbone that was buried underground for 7-8 weeks

3 讨论

传统的骨骼DNA提取方法，步骤较繁琐，耗时也长。本文方法步骤简单、提取时间短且成功率高，优点明显，表现为：

1) 直接用刀片切取和压碎机压碎骨骼样本，可防止研磨骨粉因产热而所致的DNA降解[4]。

2) 所用试剂盒中的裂解液PrepFiler BTA Lysis Buffer裂解能力强，可直接裂解骨碎片且无需单独进行脱钙处理。而传统的骨骼DNA提取方法需要进行单独的脱钙处理，会导致DNA的部分流失，遗弃的脱钙液中往往含有大量的DNA，DNA损失会达50%以上[5]。而本文方法因无需作脱钙处理，防止了DNA的丢失，提高了DNA的产量。

3) 所用试剂盒中的纳米磁珠吸附核酸效果好，DNA回收率高，多次洗涤又保证了DNA的高纯度。

4) 传统骨骼DNA提取方法脱钙时间较长，一般在12 ～ 24 h 以上[6-7]，而本文方法同时进行脱钙和裂解，直接裂解1 h即可，使DNA提取在2 h内就能完成，结合Global filerTMExpress扩增试剂盒进行快速扩增，DNA分型检验的整个过程在4.5 h就能完成，非常适合灾害事故遇难者身份识别（disaster victim identi fication, DVI）的身源鉴定。

5) 37份骨骼提取DNA样本都获得了扩增试剂盒应显现的全部STR分型结果。该扩增试剂盒的SE33基因座片段长度约306 ～ 444 bp，在低拷贝DNA扩增时容易丢失等位基因，而在本实验中该等位基因未丢失。因此，本文方法提取骨骼DNA的浓度、纯度都较高，检验成功率高。

综上所述，本文采用优化的PrepFiler BTA Forensic DNA试剂盒法结合Global filerTMExpress扩增试剂盒检验骨骼DNA大大缩短了检验时间，具有操作简便、试剂无毒、所需样本量少、能快速获得完整DNA分型等优点，适合骨骼检验使用，特别在DVI快速检验中可选用。