热休克蛋白70-hom基因+2437 T/C位点基因多态性与慢性心力衰竭患者预后的关系研究

张伟，宋小英，李芸

热休克蛋白（heat shock protein，HSP）是一类广泛存在于哺乳动物体内的高度保守的热应激蛋白，按照蛋白大小分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60及小分子HSP。近年来越来越多研究证实，HSP70可维持钙离子动态平衡，减轻由钙离子介导的心肌损伤［1-2］；此外，其还参与慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）病理生理过程，且与CHF患者病情严重程度及远期预后有关［3-4］。HSP70-hom基因+2437 T/C位点属于非同义突变，该位点突变可直接影响HSP70结构、稳定性并与多种疾病有关［5-6］。本研究旨在探讨HSP70-hom基因+2437 T/C位点基因多态性与CHF患者预后的关系，为改善CHF患者预后提供参考依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2013年1月—2015年7月延安大学附属医院东关分院心内科收治的CHF患者366例，年龄18～80岁，均符合中华医学会心血管病学分会制定的《中国心力衰竭诊断和治疗指南2014》［7］中的CHF诊断标准；并排除合并心脏瓣膜病、先天性心脏病、心包疾病、心肌炎等其他类型心脏病者，合并严重肝肾疾病、恶性肿瘤、内分泌系统疾病、血液系统疾病、风湿免疫系统疾病、感染性疾病者，妊娠期妇女。按照随访结果将所有患者分为预后不良组90例和预后良好组276例。本研究经延安大学附属医院东关分院伦理委员会审核批准，所有患者及其家属知情并签署知情同意书。

1.2 观察指标

1.2.1 临床特征 分析所有患者临床特征，包括年龄、性别、体质指数、有无冠心病、有无高血压、有无糖尿病、吸烟（吸烟≥1支/d且至少吸烟3个月者定义为吸烟）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）、纽约心脏病协会（NYHA）分级。所有患者入院后采用Philips公司生产的Elite型多普勒彩色超声心动图检测左心室舒张末期内径（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、右心室舒张末期内径（right ventricular end diastolic diameter，RVEDD）及左心室射血分数（1eft ventrieular ejection fraction，LVEF）。

1.2.2 血清HSP70水平 采集所有患者清晨空腹外周静脉血并置于肝素抗凝的无菌聚丙烯试管中，3 000 r/min离心5 min（离心半径13.5 cm），留取上清液并置于-20 ℃冰箱中保存待测，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清HSP70水平，试剂盒购自美国R&D公司，并严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.3 基因多态性 基因多态性检测方法如下：（1）DNA提取：采集患者清晨空腹外周静脉血，采用DNA提取试剂盒〔天根生化科技（北京）有限公司生产〕提取全血基因组DNA；（2）聚合酶链式反应（PCR）扩增：PCR反应体系主要包括上游引物（上游引物序列：5′-GGACAAGTCTGAGAAGGTACAG-3′）和下游引物（下游引物序列：5′-GTAACTTAGATTCAGGTCTGG-3′）各 1 μl、dNTP混合物 2 μl、Taq DNA聚合酶0.25 μl、模板 DNA 1 μl、10×Buffer 2.5 μl。反应条件：95 ℃预变性4 min，然后按照变性95 ℃ 20 s、退火60 ℃ 30 s、延长72 ℃ 50 s的顺序循环30个周期，最后72 ℃延长3 min；（3）酶切：取0.5 μl延伸产物，采用限制性内切酶NcoⅠ进行酶切，酶切体系包括 PCR 产物 17 μl、10×Buffer 2 μl、内切酶 1 μl，反应条件为37 ℃ 16 h，然后于65 ℃下酶切10 min终止反应；（4）基因型判读：取酶切产物进行电泳，其中仅有1条878 bp电泳带为C/C基因型，有2条长度分别为327、551 bp电泳带为T/T基因型，有3条长度分别为327、551、878 bp电泳带为T/C基因型，HSP70-hom基因+2437 T/C位点聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）电泳图见图1。

1.3 随访 所有患者出院后1个月内门诊随访1次，之后每3个月门诊或电话随访1次，至少随访2年。记录所有患者随访期间心血管事件发生情况，包括心源性死亡（心源性猝死及充血性心力衰竭导致的死亡）、心脏移植、恶性心律失常及CHF再住院。本研究将随访期间发生心血管事件定义为预后不良，未发生心血管事件定义为预后良好。

图1 HSP70-hom基因+2437 T/C位点PCR-RFLP电泳图Figure 1 PCR-RFLP electrophoresis for HSP70-hom gene +2437 T/C locus

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理，符合正态分布的计量资料以（x ±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验；不符合正态分布的计量资料以M（QR）表示，组间比较采用Kruskal-Wallis检验；计数资料分析采用χ2检验；Hardy-Weinberg平衡定律采用吻合度检验；CHF患者预后影响因素分析采用多因素Logistic回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg遗传平衡 本组患者中T/T基因型者236例（占64.5%）、T/C基因型者115例（占31.4%）、C/C基因型者15例（占4.1%），基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡（χ2=0.044，P＞0.05）。

2.2 不同基因型患者血清HSP70水平比较 T/T基因型患者血清HSP70水平为12.4（3.6）μg/L，T/C基因型患者为12.3（3.4）μg/L，C/C基因型患者为11.0（3.1）μg/L；不同基因型患者血清HSP70水平比较，差异无统计学意义（u=1.329，P＞0.05）。

2.3 不同预后患者临床特征比较 预后良好组和预后不良组患者男性比例、体质指数、冠心病发生率、高血压发生率、糖尿病发生率、吸烟率、TG、LDL-C比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；预后不良组患者年龄大于预后良好组，BNP、NYHA分级Ⅲ～Ⅳ级者所占比例及LVEF高于预后良好组，LVEDD、RVEDD长于预后良好组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

2.4 不同预后患者基因型及等位基因比较 预后良好组和预后不良组患者基因型比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；而等位基因分布频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表2）。

2.5 CHF患者预后影响因素分析 将表1～2中有统计学差异的指标作为自变量，将预后作为因变量（变量赋值见表3）进行多因素Logistic回归分析，结果显示，BNP、RVEDD、LVEF及基因型是CHF患者预后的独立影响因素（P＜0.05，见表4）。

表1 不同预后患者临床特征比较Table 1 Comparison of clinical features in patients with different prognosis

表2 不同预后患者基因型和等位基因分布频率比较〔n（%）〕Table 2 Comparison of genotypes and allelic frequency in patients with different prognosis

表3 变量赋值Table 3 Variable assignment

表4 CHF患者预后影响因素的多因素Logistic回归分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis on influencing factors of prognosis in patients with CHF

3 讨论

HSP家族最重要的生物学功能是在各种应激状态下维持细胞自身稳定，故被认为是细胞损伤的保护因素。近年来不断有研究发现，多个HSP家族成员均参与了CHF的发生发展过程，其中HSP70关注较多［3-4，8］。既往有研究显示，急性心力衰竭（acute heart failure，AHF）患者血清HSP70水平明显升高，分析原因可能与坏死的心肌细胞释放大量HSP70入血及机体启动应激保护机制有关［9］；而CHF患者血清HSP70水平明显降低，分析原因可能为心力衰竭患者心肌细胞功能减退，长期慢性炎性反应可抑制HSP70表达，且血清HSP70水平与年龄、CHF病程呈负相关［3］。但也有研究结果显示，HSP70水平与CHF严重程度呈正相关，病情越重则HSP70水平越高［10］。笔者分析研究结果产生不同的原因可能与纳入的CHF患者病程长短有关，病程短者HSP70水平趋近于AHF患者。

人类HSP70基因位于6p21.3，是一种高度保守基因，由HSP70-1、HSP70-2、HSP-hom组成。HSP70-hom基因+2437 T/C位点是目前研究最多的单核苷酸多态性位点之一，该位点的T→C突变是一种非同义突变，可将HSP70肽链中的一个蛋氨酸替换为苏氨酸，进而直接影响HSP70的结构及稳定性［5-6］。本研究结果显示，本组患者基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡，具有群体代表性；且不同基因型患者血清HSP70水平间无差异，提示HSP70-hom基因+2437 T/C位点基因多态性发挥生物学功能与HSP70水平无关，可能与HSP70蛋白自身结构及稳定性有关；但本研究中C/C基因型患者例数较少，故不能排除检验效能不足。

另外，不同地区、不同种族人群基因型和等位基因分布频率间具有明显差异。既往有关西方人群HSP70-hom基因+2437 T/C位点基因多态性的研究显示，突变纯合子基因型频率为5%～20%［11-12］；而我国汉族健康人群突变纯合子基因型频率为1%～5%［5-6，13-14］，本研究结果与之相一致。近年来国内外研究相继发现，HSP70-hom基因+2437 T/C位点基因多态性与脑梗死、冠心病及多种肿瘤发生有关［5-6，13，15］。本研究旨在探讨HSP70-hom基因+2437 T/C位点基因多态性与CHF患者预后的关系，结果显示，BNP、RVEDD、LVEF及基因型是CHF患者预后的独立影响因素。

综上所述，HSP70-hom基因+2437 T/C位点基因多态性与CHF患者预后有关，C/C基因型可能增加CHF患者预后不良发生风险。但本研究为单中心研究，样本量较小，且C/C基因型患者例数较少，故研究结果存在一定偏倚，仍需进一步研究证实。

作者贡献：张伟进行文章的构思与设计、研究的实施与可行性分析，数据收集、整理、分析，负责撰写论文；宋小英进行文章的质量控制及审校；李芸负责结果分析与解释，并对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。