732阳离子交换树脂对全细胞谷氨酸脱羧酶活性的促进机制

杨胜远,郭文怡,李紫君,苏巧云,黄慧玲,曾 婵,彭罗慧

(岭南师范学院化学化工学院,广东湛江 524048)

谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD,EC4.1.1.15)是一种胞内酶,广泛存在于生物细胞中,能催化L-谷氨酸(L-glutamic acid,L-Glu)的α-羧基发生脱羧反应而生成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)[1],专一性极强,已被用于新资源食品GABA的生物合成和手性物质DL-谷氨酸(DL-glutamic acid,DL-Glu)的拆分,尤其是微生物源GAD的工业化应用备受关注[1-3]。由于GAD的作用底物和产物都是小分子,能透过细胞膜,因此为了克服微生物细胞破碎难题,降低生产成本,微生物全细胞GAD转化法深受GABA或D-Glu生产领域的青睐[4-9]。然而,由于微生物GAD活力普遍偏低,致使GABA和D-Glu的生物合成成本居高不下,因此如何提高GAD催化活性是GAD工业应用亟需解决的关键问题。

对GAD激活剂的研究已有一些报道,但由于不同来源的GAD的结构存在差异,GAD激活剂存在较大差异,例如时粲等[10]发现Fe2+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、异戊醇和吐温20对大肠杆菌表达的植物乳杆菌GAD活力具有一定促进作用,陈琳等[11]发现Ca2+、Cu2+、Ni2+对大肠杆菌表达的嗜热链球菌GAD活力具有一定促进作用,然而Yang等[12]研究表明Cu2+对唾液链球菌嗜热亚种GAD具有抑制作用,但Ba2+对GAD具有促进作用。金属离子作为激活剂,对GAD活性的促进能力有限,有的金属离子存在一定毒性,并会在转化体系中引入大量的盐,对下游提取工艺和产品的安全性均不利。在全细胞GAD的转化反应中,也有文献采用表面活性剂(如Triton X-100)[11]或有机溶剂(如二甲苯)[13]对细胞进行透性化处理,破坏细胞膜的完整性,增加细胞内外对底物和产物的交换能力,对全细胞GAD的表观活力也有很好的促进作用,但用于透性化处理的有机试剂的安全性难以保证,工业透性化处理细胞的程度难以控制,工艺复杂。732阳离子交换树脂因使用方便、分离效果好、安全性高、可重复使用等优点,在绿色化学领域已被广泛用于物质的分离纯化。作者前期研究表明,732阳离子交换树脂对屎肠球菌全细胞GAD转化活性有显著的促进作用,对此尚鲜见报道,732阳离子交换树脂对全细胞GAD活性的促进机制还不清楚,亟待研究。

本文主要从732阳离子交换树脂对细胞转化体系的pH、底物效应和产物效应的角度对732阳离子交换树脂促进细胞GAD活力的作用机制进行探讨,以期为732阳离子交换树脂作为GAD促进剂在酶工程中应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

屎肠球菌(Enterococcusfaecium)GDMCC60203 作为专利菌种保藏于广东省微生物菌种保藏中心,为岭南师范学院绿色生物制造研究室从泡菜中分离获得,原菌株保藏号为LNSF2;屎肠球菌GAD纯酶 (7489.18 U/mg)为岭南师范学院绿色生物制造研究室采用亲和层析自行纯化获得,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳检验呈现单一条带,达到了电泳纯;γ-氨基丁酸(含量≥99%)和异硫氰酸苯酯(Phenylisothiocyanate,PITC) 美国Sigma-Aldrich公司;乙腈、乙酸和三乙胺 色谱纯,美国TEDIA公司产品;其余试剂 均为国产市售分析纯试剂和生化试剂;732阳离子交换树脂 廊坊沃恒化工有限公司;改良PSB(Peptone-Sucrose-Beef extract)培养基 参照文献[14]进行配制。

Agilent 1200 Series型高效液相色谱仪(配制G1354A四元梯度泵、G1316A 柱温箱、G1314B可变波长紫外检测器、Chemstation工作站等) 美国安捷伦公司;PSH-200型生化培养箱 中科生命科技股份有限公司;Centrifuge 5804R型冷冻离心机 Eppendorf公司;VX-200型漩涡混合仪 美国Labnet公司;AUW120型电子分析天平 日本Shimadzu公司。

1.2 实验方法

1.2.1E.faeciumGDMCC60203菌悬液制备 从4 ℃保藏的E.faeciumGDMCC60203斜面挑取1环菌苔接入改良PSB培养基中,37 ℃静置培养12 h,再按体积比为1∶100的接种量转接入改良PSB培养基,于37 ℃静置培养12 h作为种子液,然后将种子液按体积比为1︰50的接种量接入改良PSB培养基,于37 ℃静置培养48 h,作为发酵醪。将发酵醪在4 ℃于8500 r/min离心20 min,收集菌体。分别在含菌体的离心管中加入50 mL 0.85 g/L NaCl溶液,搅散菌体进行重悬洗涤,然后在4 ℃于8500 r/min离心15 min,收集菌体。每克湿菌体加入10 mL pH4.2、0.2 mol/L乙酸盐缓冲液,均质分散均匀,制成100 mg/mL菌悬液。

1.2.2 732阳离子交换树脂的再生和平衡 再生:用约2倍树脂体积的1 mol/L NaOH溶液浸泡20～30 min,以蒸馏水洗至中性,然后用约2倍树脂体积的1 mol/L HCl溶液浸泡20～30 min,再用蒸馏水洗至中性,备用。

乙酸盐缓冲液平衡树脂:称取20 g 树脂加入pH4.2、0.2 mol/L乙酸盐缓冲液40 mL,室温间歇搅拌浸泡30 min,尼龙滤布过滤,再以相同pH的乙酸盐缓冲液重复平衡至滤液pH基本接近于4.2。

L-Glu溶液平衡树脂:分别称取树脂20 g与pH分别为4.2、4.6、5.0、5.4的0.3 mol/LL-Glu溶液(溶剂为0.2 mol/L乙酸盐缓冲液)40 mL混合,室温间歇搅拌浸泡30 min,尼龙滤布过滤取树脂,重复平衡直至滤液pH与原L-Glu溶液的pH基本一致。

1.2.3 HPLC测定GABA和L-Glu含量的方法 参照文献[15]进行。取100 μL标准溶液或样品液注入1.5 mL的锥形离心管,加入50 μL 乙腈-水-三乙胺-PITC(体积比7∶1∶1∶1),混匀,室温下放置1 h 后,加入150 μL 流动相A-流动相B(体积比80∶20),漩涡混合器振荡1 min,然后加入600 μL正己烷,漩涡混合器振荡1 min,静置10 min。用注射器吸取下层溶液,经0.22 μm滤膜过滤备测。HPLC色谱条件为:ZORBAX Eclipse XDB C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱;检测波长254 nm;进样量20 μL,柱温25 ℃;采用流动相A与流动相B体积比80∶20,以0.6 mL/min线性等梯度洗脱。流动相A:pH5.8、0.1 mol/L乙酸盐缓冲液,每升缓冲液中分别含三乙胺0.5 mL、乙酸0.7 mL和乙腈 5.0 mL。流动相B:60%乙腈溶液。

1.2.4 732阳离子交换树脂交换物的洗脱方法 采用0.15 mol/L Na2CO3溶液进行洗脱。将树脂浸泡在20 mL Na2CO3溶液中,室温振荡洗脱5 min,滤布过滤,取洗脱液,重复洗脱2次,合并洗脱液。将洗脱液于4 ℃,8500 r/min离心5 min,取上清液备测。

1.2.5 GAD纯酶和全细胞GAD活性的测定 GAD纯酶活性的测定:将L-Glu溶液(溶剂为0.2 mol/L乙酸盐缓冲液)1.5 mL与GAD纯酶0.5 mL混合,40 ℃水浴反应30 min,立即加入-20 ℃冷冻的无水乙醇2 mL,混匀,于4 ℃、8500 r/min离心15 min,取上清液采用HPLC测定GABA含量;以121 ℃灭活10 min的GAD纯酶代替实验组GAD纯酶按同样操作作为空白对照。全细胞GAD活性的测定:将L-Glu溶液(溶剂为0.2 mol/L乙酸盐缓冲液)1 mL与菌悬液1 mL混合,于40 ℃水浴反应6 h,立即加入-20 ℃冷冻的无水乙醇2 mL,于 4 ℃、8500 r/min离心15 min,取上清液采用HPLC测定GABA含量;以121 ℃灭菌20 min的菌悬液代替实验组菌悬液进行同样操作作为空白对照。GAD纯酶或全细胞GAD酶活力定义:在测定条件下1 h生成1 μmol GABA所需要的酶量为1个酶活单位(U)。实验结果以每毫升纯酶或菌悬液的GAD活力(U/mL)进行表示,并以平均活力最高的实验组酶活力作为100%计算相对酶活力(%)。

GAD纯酶或全细胞GAD催化生成的GABA的浓度按照式(1)进行计算,单位体积GAD或全细胞GAD的活力按照式(2)进行计算。

Ci=Ct-C0

式(1)

式(1)中,Ci为实验组反应终止液中由转化反应合成的GABA浓度,mmol/L;Ct为实验组反应终止液的GABA浓度,mmol/L;C0为对照组反应终止液的GABA浓度,mmol/L。

式(2)

式(2)中,Ci为实验组反应终止液中由转化反应合成的GABA浓度,mmol/L;Vi为实验组反应液的体积,mL;V为实验组GAD纯酶或菌悬液的体积,mL;1000为单位换算系数。

1.2.6 pH对GAD纯酶和全细胞GAD活性的影响 分别以pH4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8的0.3 mol/LL-Glu溶液(溶剂为0.2 mol/L乙酸盐缓冲液)作为底物,分别按照1.2.5测定GAD纯酶和全细胞GAD的活性。

1.2.7 732阳离子交换树脂对反应体系pH的影响 称取经L-Glu平衡的树脂10 g,加入0.3 mol/LL-Glu溶液(溶剂为0.2 mol/L乙酸盐缓冲液)10 mL、菌悬液10 mL,混匀,分别于80 r/min、40 ℃水浴振荡器反应0、3、6、9、12、24 h,尼龙滤布过滤,分别收集滤液和树脂,将滤液立即于4 ℃、8500 r/min离心15 min,收集上清液(记为转化液),并测定转化液的pH;对树脂进行洗脱(记为洗脱液),将洗脱液于4 ℃、8500 r/min离心15 min,去除沉淀。分别测定转化液和树脂洗脱液的GABA含量。以不加树脂按同样操作作为对照组。

1.2.8 GABA对GAD纯酶和全细胞GAD活性的影响 分别以pH4.2的0.25 mol/LL-Glu溶液(溶剂为0.2 mol/L乙酸盐缓冲液)、L-Glu/GABA混合溶液(溶剂为0.2 mol/L乙酸盐缓冲液,L-Glu终浓度为0.25 mol/L,GABA终浓度为0.2 mol/L)作为底物,按照1.2.5测定GAD纯酶和全细胞GAD的活性。

1.2.9 全细胞对GABA的代谢作用 分别取pH分别为4.2、4.6、5.0、5.4、5.8的0.3 mol/L GABA溶液(溶剂为0.2 mol/L乙酸盐缓冲液)1 mL与菌悬液1 mL混匀,40 ℃水浴反应6 h,立即加入-20 ℃冷冻的无水乙醇2 mL,于4 ℃、8500 r/min离心15 min,取上清液测定GABA含量。以121 ℃灭菌20 min的菌悬液1 mL按同样操作作为对照。通过比较实验组与对照组中反应液GABA浓度的差异评价细胞对GABA的代谢作用。

1.2.10 GABA对732阳离子交换树脂结合的L-Glu的交换能力 分别称取经pH4.2、4.6、5.0和5.4L-Glu溶液(溶剂为0.2 mol/L乙酸盐缓冲液)平衡的树脂4 g,加入对应pH的0.2 mol/L乙酸盐缓冲液8 mL,室温浸泡5 min,洗涤未交换的L-Glu,滤布过滤,将树脂分别加入对应pH的0.2 mol/L GABA溶液(溶剂为0.2 mol/L乙酸盐缓冲液)8 mL,室温浸泡30 min,间歇搅拌,滤布过滤,滤液记为交换液;将树脂分别加入对应pH的0.2 mol/L乙酸盐缓冲液8 mL,室温浸泡5 min,洗涤未交换的GABA,滤布过滤,然后对树脂进行洗脱,重复洗脱2次,合并洗脱液。分别测定交换液L-Glu的含量及洗脱液L-Glu和GABA的含量。

1.2.11L-Glu浓度对GAD纯酶和全细胞GAD活性的影响 分别以pH4.2的4.8、9.6、19.2、25.6、51.2、76.8、89.6、102.4、128 mmol/LL-Glu溶液(溶剂为0.2 mol/L乙酸盐缓冲液)作为底物,按照1.2.5测定GAD纯酶的活性;分别以pH4.2的50、100、150、200、250、300 mmol/LL-Glu溶液(溶剂为0.2 mol/L乙酸盐缓冲液)作为底物,按照1.2.5测定全细胞GAD的活性。

1.2.12 不同平衡方法制备的732阳离子交换树脂对全细胞GAD活力的影响 分别取乙酸盐缓冲液平衡树脂和L-Glu溶液平衡树脂各10 g,分别加入pH4.2、0.3 mol/LL-Glu溶液(溶剂为0.2 mol/L乙酸盐缓冲液)10 mL、菌悬液10 mL,混匀,分别于80 r/min、40 ℃水浴振荡器反应24 h,尼龙滤布过滤,分别收集滤液和树脂,将滤液立即于4 ℃、8500 r/min离心15 min,收集上清液(记为转化液);对树脂进行洗脱(记为洗脱液),将洗脱液于4 ℃、8500 r/min离心15 min,去除沉淀。分别测定转化液和树脂洗脱液的GABA含量。以不添加732阳离子交换树脂按同样操作作为对照,以对照组GABA产量作为基准按式(3)计算实验组GABA增产率(%)比较树脂对全细胞活力的影响。

式(3)

式(3)中,P1为对照组GABA产量,mmol;P2为实验组GABA产量,mmol;100为百分比换算系数。

1.3 数据分析

采用IBM SPSS Statistics 19.0软件以独立样本t检验进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 pH对GAD纯酶和全细胞GAD活性的影响

从图1可见,游离GAD纯酶的最适反应pH为5.0,而全细胞GAD的最适反应pH为4.4,低于纯酶的最适反应pH,结果表明全细胞存在传质障碍,需要细胞外环境的pH达到4.4,才能保证细胞内的pH达到5.0,即需要一定浓度差以促进细胞内外H+和碱化因子的交换速度。图1显示,当pH偏离最适反应pH时,GAD纯酶和全细胞GAD的活力均下降较快,由此可见反应体系pH是影响GAD活力的重要因素。

图1 pH对游离GAD纯酶和全细胞GAD反应活性的影响Fig.1 Effects of pH value on the GAD activity of free purified enzymes and whole cells

2.2 732阳离子交换树脂对反应体系pH的影响

图2对全细胞GAD转化体系的pH和GABA产量进行了监测,结果显示随着全细胞GAD转化反应时间延长,实验组和对照组的反应体系的pH和GABA产量均呈上升趋势,但实验组GABA产量在各时间段均高于对照组,而反应体系的pH略低于对照组。

图2 732阳离子交换树脂对细胞GAD转化体系pH的影响Fig.2 Effects of 732 cation-exchange resins on the pH of whole cells’ GAD bio-transformation system

GAD催化L-Glu发生α-羧基脱羧生成GABA会消耗H+,从而会造成pH升高[16-20]。理论上,实验组GABA产量高于对照组(图2),其反应体系的碱化作用应该会更强,反应体系的pH升高应更明显,然而实验组反应体系的pH却低于对照组,即实验组pH偏离GAD最适反应pH较对照组更小,说明实验组添加的732阳离子交换树脂对反应体系的pH有较好的稳定作用。

图1已表明GAD的活性对反应体系pH敏感,反应体系pH越接近最适反应pH,GAD活力越高。随着全细胞GAD催化反应进行,体系的pH逐渐提高,将导致GAD活力逐渐降低。因此,细胞内的碱性物质能否及时排除,细胞外的H+能否及时进入细胞,是影响全细胞GAD活力的关键因素,然而图1表明细胞存在传质障碍,细胞内外需要存在一定H+浓度差,才能稳定胞内pH。732阳离子交换树脂是强酸型离子交换树脂,当与阳离子发生离子交换时,会释放H+,从而增加细胞外的H+浓度,提高H+进入细胞内的速度,及时中和催化反应产生的碱,调节细胞内反应pH,保证细胞GAD能在相对较适宜的环境下进行催化反应,从而在表观上对GAD活力呈现促进作用。

2.3 732阳离子交换树脂对全细胞GAD产物效应的影响

2.3.1 GABA对GAD纯酶和全细胞GAD活性的影响 从图3可见,当L-Glu底物溶液中含200 mmol/L GABA时,全细胞GAD活力低于不含GABA的实验组,差异极显著(p<0.01),说明GABA对全细胞GAD的转化活性具有抑制作用;然而,GABA对游离GAD纯酶的活力却影响不大,含200 mmol/L GABA的实验组与不含GABA的实验组差异不显著(p>0.05),说明GABA对游离GAD纯酶的转化活性不存在抑制作用。

图3 底物中初始GABA浓度对细胞GAD和游离GAD纯酶活力的影响Fig.3 Effect of initial GABA concentration on the GAD activity of whole cells and free purified enzymes

2.3.2 全细胞对GABA的代谢作用 为了确定GABA对全细胞GAD和游离细胞GAD活力的影响不一致的原因,图4对全细胞在转化反应过程中是否存在下游酶进一步代谢GAD催化反应产物GABA的情况进行了测定,结果(图4)表明,当以GABA溶液作为底物进行全细胞转化反应,在pH4.2～5.8范围内,实验组与对照组的GABA浓度无显著性差异(p>0.05),说明在全细胞GAD转化反应过程中不存在GABA被下游酶代谢的情况。

图4 pH对细胞GABA代谢的影响Fig.4 Effect of pH value on the GABA metabolism of whole cells

2.3.3 GABA对732阳离子交换树脂结合的L-Glu的交换能力 从表1树脂洗脱液的GABA总量和交换能力测试结果可见,在pH4.2～5.4范围内,732阳离子交换树脂对L-Glu和GABA均具有一定交换结合能力;虽然每克树脂对GABA交换能力随pH升高而由(267.26±15.20) μmol下降到(89.25±2.85) μmol,但是树脂对GABA交换结合能力在测试pH下均强于L-Glu,GABA可与732阳离子交换树脂平衡时所交换的L-Glu发生离子交换而结合于732阳离子交换树脂。

表1 GABA对732阳离子交换树脂吸附的L-Glu交换能力Table 1 Exchange capacity of GABA to L-Glu adsorbed by 732 cation exchange resins

GABA的等电点为pI 7.19[22],在pH4.2～5.4范围内带正电荷,随着溶液pH升高,正电荷离子减少,树脂对GABA交换吸附能力下降,实验结果与理论相符。L-Glu等电点为pI 3.22,理论上在pH4.2～5.4范围内带负电荷,但L-Glu有2个-COOH,γ位的-COOH的电离常数pKR为4.25,因此在pH4.2～5.4范围仍存在一定L-Glu阳离子,可与732阳离子交换树脂发生弱离子交换,离子交换的同时也促进了L-Glu的电离平衡向阳离子一侧移动,导致732阳离子交换树脂对L-Glu也具有一定离子交换能力,这可能是表1树脂对L-Glu也存在一定交换吸附能力并随着环境pH升高而呈现下降的主要原因。

2.3.4 732阳离子交换树脂对全细胞GAD产物效应影响的综合分析 GABA是GAD催化反应产物,图3表明GABA对GAD纯酶的表观活力无抑制作用而对全细胞GAD的表观活力却有抑制作用,可能存在两方面原因:一是由于细胞中存在代谢GABA的下游酶,如γ-氨基丁酸转氨酶和γ-氨基丁酸转氨酶-琥珀酸半醛脱氢酶偶联酶[21],当转化反应体系pH升高至下游GABA代谢酶的反应活性范围,将会导致部分GABA被进一步代谢,从而导致GAD表观活性下降;二是伴随转化反应进行,细胞内GABA产物浓度不断增大,因全细胞存在传质障碍,GABA不能及时排出细胞外,造成GABA不能及时离开GAD活性中心,减缓L-Glu进入GAD活性中心的速度,从而造成反应速度下降,GAD活力降低。

然而,图4表明在全细胞转化反应过程中不存在GABA被下游酶代谢的情况,同时表1表明GABA与732阳离子交换树脂的离子交换能力较强。因此,GABA抑制全细胞GAD活性的原因应为上述第二种情况。当在全细胞GAD转化反应中添加732阳离子交换树脂时,由于反应产物GABA可交换结合于树脂,将可降低反应液中游离GABA浓度,增大细胞内外GABA浓度差,有利于细胞内转化反应产物GABA向细胞外传递,进而提高GABA离开GAD酶活性中心的速度,促进细胞GAD的表观活力。由此可见,通过离子交换结合GABA,减少反应液游离GABA浓度,加快细胞向外运出GABA的速度而促进细胞GAD的活力,这是732阳离子交换树脂促进全细胞活性的另一机制。

2.4 732阳离子交换树脂对全细胞GAD底物效应的影响

2.4.1L-Glu浓度对GAD纯酶和全细胞GAD活性的影响 图5显示,L-Glu浓度对游离GAD纯酶和全细胞GAD的转化活性影响均较大,随着L-Glu浓度增大,游离GAD纯酶的活性增强,当L-Glu浓度达到76.8 mmol/L以上时,游离GAD纯酶的转化活力达到最大值,继续增加L-Glu浓度,GAD纯酶的活力趋于恒定;全细胞GAD的转化活性也随L-Glu浓度增大而增强,当L-Glu浓度为200 mmol/L以上时,全细胞GAD的转化活性达到最大值,继续增加L-Glu浓度,GAD纯酶的活力趋于恒定。结果表明,GAD纯酶和全细胞GAD均不受L-Glu抑制,不存在底物抑制效应。然而,从图5可见,GAD纯酶活力达到最大时的L-Glu浓度仅为76.8 mmol/L,而全细胞GAD需要L-Glu浓度达到200 mmol/L以上时才能达到最大活力,说明全细胞存在传质障碍,需要转化液L-Glu浓度达到200 mmol/L以上时,才能使细胞内L-Glu浓度达到76.8 mmol/L以上,从而保证细胞GAD的酶活性中心的处于底物饱和状态而发挥最大催化活力。

图5 L-Glu对细胞GAD和游离GAD纯酶活力的影响Fig.5 Effect of L-Glu on the GAD activity of whole cells and free purified enzymes

2.4.2 不同平衡方法制备的732阳离子交换树脂对全细胞GAD活力的影响 从图6可见,仅用乙酸盐缓冲液平衡的树脂对全细胞GAD的转化活性没有促进作用,细胞转化活性甚至略有下降,但不显著(p>0.05),而采用L-Glu溶液平衡的树脂却可显著提高细胞GAD活力(p<0.05),GABA产量提高了27.27%±3.17%。

图6 732阳离子交换树脂的平衡方法对全细胞GAD转化体系GABA增产率的影响Fig.6 Effect of the balance method of 732 cation-exchange resins on the GABA yield increase rate of whole cells GAD transformation system

732阳离子交换树脂对L-Glu具有一定离子交换作用(表1),当反应体系中加入仅用乙酸盐缓冲液平衡的树脂时,树脂会交换吸附L-Glu而造成反应液中游离L-Glu浓度降低,而反应液L-Glu浓度达到200 mmol/L以上时,才能保证全细胞GAD达到最大酶活性(图5),因此在反应体系加入仅用乙酸盐缓冲液平衡的树脂时,将造成全细胞GAD长时间处于相对较低L-Glu浓度的条件下进行反应,导致全细胞GAD的表观活力下降,并且这种影响较大,甚至掩盖了树脂稳定反应体系pH和降低反应液游离GABA浓度所产生的促进作用;而以L-Glu溶液平衡的树脂由于已经交换吸附L-Glu,当反应体系中加入该树脂时,不会再交换吸附反应液中的游离L-Glu,伴随转化反应进行,pH和GABA浓度升高,树脂原吸附的L-Glu将与GABA发生离子交换而释放出来,补充因反应而消耗的游离L-Glu,从而在较长时间内维持全细胞GAD处于高L-Glu浓度下进行催化反应,从而促进全细胞GAD表观活力。

2.4.3 732阳离子交换树脂对全细胞GAD底物效应影响的综合分析 虽然全细胞GAD活力无底物抑制效应,但存在传质障碍,需要转化液L-Glu浓度达到200 mmol/L以上时才能达到全细胞GAD最大活力(图5)。由于L-Glu在水中的溶解度较小,25 ℃时的溶解度仅为0.864%[23],在pH4.2、0.2 mol/L 乙酸盐缓冲液中的溶解度更小,实验使用的0.3 mol/LL-Glu溶液在40 ℃已基本达到饱和,较全细胞GAD最大催化活力所需底物浓度(200 mmol/L)仅高100 mmol/L。随着全细胞GAD转化反应进行,L-Glu将被大量消耗而浓度降低,当L-Glu浓度低于200 mmol/L,全细胞GAD将因底物浓度不足而活力下降。当存在L-Glu溶液平衡的树脂时,树脂原吸附的L-Glu在反应过程中可与反应产物GABA发生离子交换而释放出来,补充到反应液中,维持反应液的游离L-Glu浓度,从而使全细胞能在较长的时间内保持最大活力,即全细胞GAD表观活力提高。

由此可见,通过向反应体系补充酶反应底物而促进L-Glu向细胞内运送也是732阳离子交换树脂促进全细胞GAD活力的重要机制之一。

3 讨论与结论

732阳离子交换树脂能通过离子交换而给出质子或者接受电子对,广义上可作为固体酸应用于酸碱催化反应。理论上,如能精密控制反应过程产生的碱与732阳离子交换树脂的H+发生1∶1交换,则可利用732阳离子交换树脂精确控制反应体系的pH。GAD催化L-Glu脱羧后,反应体系的pH会升高,逐渐偏离GAD适宜反应pH,从而导致GAD活力下降。研究也证实732阳离子交换树脂对控制反应液的pH具有很好的效果(图2)。Dinh等[24]利用Amberlyst 15阳离子交换树脂对GAD游离酶催化反应体系的pH控制效果的也进行了探讨,结果表明Amberlyst 15阳离子交换树脂可通过与反应体系的Na+发生离子交换而释放H+,从而达到了控制反应体系的pH和减少反应体系的游离盐的目的,GABA产量显著增加。图1表明,全细胞GAD的最适反应pH低于游离GAD,说明存在传质障碍,需要细胞外的反应液的pH较GAD最适反应pH低0.6,才能保证细胞内的pH达到GAD的最适反应pH,从图1还可知GAD活力对pH较敏感,GAD活力随pH的偏离而快速下降,因此及时提高反应液H+浓度,稳定反应体系的pH,对保持GAD活力尤为重要。732阳离子交换树脂通过离子交换作用,能及时释放H+和接受可碱化反应液的GABA,对反应体系pH具有很好的调节作用。由此可见,通过离子交换释放H+和去除游离碱化因子,调节反应体系pH,是阳离子交换树脂促进GAD活力的重要途径。

表1表明732阳离子交换树脂可交换结合GABA,因此可有效降低反应液中游离GABA的浓度,加快细胞内的GABA向细胞外传递的速度,降低细胞内GABA浓度,加快GABA离开酶活性中心,从而促进细胞GAD的活力。图5也表明,由于存在传质障碍,细胞GAD相对于游离GAD需要更高的L-Glu浓度才能维持较高的活力,表1显示经L-Glu平衡的732阳离子交换树脂可通过与GABA交换而释放出L-Glu,补充因反应而消耗的底物,延长高浓度底物的时间,加快底物进入细胞的速度,从而促进细胞GAD的表观活力。因此,通过减小游离GABA浓度和维持L-Glu浓度而加快细胞传质速度,是732阳离子交换树脂促进细胞GAD活力的另外两个方面的作用机制。由于游离酶不存在细胞传质障碍,因此这两方面的机制体现不显著。

斯晗[21]研究表明谷氨酸棒杆菌催化GABA分解代谢的γ-氨基丁酸转氨酶和γ-氨基丁酸转氨酶-琥珀酸半醛脱氢酶偶联酶在pH5.0以上时已具有催化活性,当pH大于6.0时,酶活性快速升高。然而,图4显示在pH4.2～5.8范围内,不存在GABA被下游酶代谢的情况,可能测试的pH尚未达到E.faeciumGDMCC60203代谢GABA的γ-氨基丁酸转氨酶或γ-氨基丁酸转氨酶-琥珀酸半醛脱氢酶偶联酶的活性依赖的pH。基于732阳离子交换树脂可交换结合GABA,减少游离GABA,预期732阳离子交换树脂在防止GABA被下游酶代谢方面也将有很好的作用,有待进一步验证。

综合以上分析可见,732阳离子交换树脂可以通过离子交换而释放H+、L-Glu及结合GABA,调节反应液pH,并增加反应液中游离底物浓度和降低游离产物浓度,增大细胞内外浓度差,克服细胞传质障碍,加快细胞内外物质运送速度,从而提高细胞GAD的表观活力。