秃疮花针剂对小鼠淋巴细胞CD4和CD8的影响

党 岩,陈德坤,姚 婧,赵燕清,赵丽娟,杨增歧,李引乾,杨鸣琦, 马志宏, 苟想珍,张莉敏,常攀峰

(1.甘肃省畜牧兽医研究所, 甘肃 平凉 744000； 2．西北农林科技大学动物医学院)

秃疮花(Dicranostigma leptopodum (Maxim) Fedde，DLF)，为罂粟科秃疮花属二年生或多年野生草本植物, 主要分布在甘肃、陕西等地。多年来我国许多研究者对秃疮花的成分和秃疮花制剂的药理作用进行了研究，畅行若等从秃疮花中提取出秃疮花碱、异紫堇碱、紫堇碱、原阿片碱、别隐品碱、青风藤碱等多种化合物。卢贤昭等研究表明，秃疮花制剂能调节动物免疫系统机能、对结核病和肿瘤等有良好的治愈作用、对多种细菌、病毒、真菌性疾病和外科创伤等有治疗作用。

为了将药用植物秃疮药应用于临床实践中，本课题组在分析秃疮花全草生物碱成分的同时，进行了秃疮花制剂的研制和应用。在此基础上，进一步研究秃疮花制剂对小鼠淋巴细胞CD4和CD8的影响，为制剂的应用奠定试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 Balb/c小鼠 购于第四军医大学试验动物中心。

1.1.2 制剂 秃疮花针剂由甘肃省畜牧兽医研究所制备。

1.1.3 仪器与材料 流式细胞仪 为第四军医大学中心试验室仪器(BD公司)；离心机等为西北农林科技大学动物医学学院预防兽医学试验平台仪器； 96孔细胞培养板、细胞计数板、0.1μL-1μL、1μL-10μL、10μL-100μL、100μL-1 000μL、1mL-10 mL加样枪及EP管等购于欣博盛生物科技有限公司。

1.1.4 试剂与药品 小鼠IL-4 ELISA试剂盒和小鼠IFN-γELISA试剂盒等为欣博盛生物科技有限公司；PBMI-1640培养液、HEPES、L-谷氨酰胺、ConA、犊牛血清、NaCl、KCl、Na2HPO4.12H2O、KH2PO4、NaHCO3、葡萄糖、台盼蓝、青链霉素、两性霉素、多聚甲醛等购于欣博盛生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 秃疮花内用针剂对小鼠的腹腔注射(1)秃疮花内用针剂配制 取甘肃省畜牧兽医研究所制备的秃疮花制剂，按其所含干物质量用生理盐水配制成4 mg/mL、20 mg/mL、100 mg/mL各100 mL, 4℃保存备用。(2)秃疮花内用针剂对小鼠的腹腔注射 取28日龄Balb/c小鼠40只，观察2 d，随机分成4组。3个试验组每天分别腹腔注射4 mg/mL、20 mg/mL、100 mg/mL的秃疮花内用制剂，0.2 mL/每只;另1对照组每天分别腹腔注射生理盐水，0.2 mL/每只。各组连续注射7 d后。

1.2.2 秃疮花内用针剂对小鼠淋巴细胞CD4和CD8的影响(1) 淋巴细胞分离 从1.2.1.2处理的3个试验组和对照组中随机各取5只小鼠，断颈处死，75%乙醇消毒，无菌条件下取小鼠脾脏。合并同组小鼠脾脏，过200目筛网，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。各组分离的淋巴细胞分别用PBS液(pH 7.4)洗3遍，计数，将其分别配成1×106个细胞/mL。(2) 小鼠淋巴细胞标记与固定分别取1.2.2.3各组1×106个细胞/mL 200μL 淋巴细胞悬液，各分置两个EP管中，每管100 μL。

在避光条件下分别加入Alexa Fluor488 anti-mouse CD4 或Alexa Fluor488 anti-mouse CD8抗体1μL，混匀后4℃作用30 min。离心弃上清，加入100 uL 1% 多聚甲醛固定，4℃保存待测。(3)小鼠淋巴细胞的体外培养、标记和固定 分别取1.2.2.1各组1×106个细胞/ml 500μL 淋巴细胞悬液，分别离心弃上清，淋巴细胞用500μL 完全PBMI-1640营养液重悬后，各分置96孔细胞培养板的4个培养孔中，每孔100 μL。各孔分别加入10 μg/mL的ConA 100 μL，5%CO2、37℃培养48 h。各孔培养物分别离心弃上清，分别用PBS液(pH 7.4)洗3遍，用100μLPBS液重悬，淋巴细胞标记与固定同(4)荧光值检测 分别将两次?标记与固定的淋巴细胞用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。

2 结果与讨论

2.1 结果

秃疮花内用针剂对小鼠淋巴细胞CD4和CD8的影响结果见下图和表1。从下图和表1可以看出，小鼠腹腔注射秃疮花内用针剂7d后，与对照组(0 mg/ mL组)相比，小鼠淋巴细胞CD4+数量明显下降，但小鼠淋巴细胞CD8+数量明显增加;分离秃疮花针剂处理的小鼠淋巴细胞，用ConA 刺激，5%CO2、37℃培养48 h后，与对照组相比，小鼠淋巴细胞CD4+数量明显下降，小鼠淋巴细胞CD8+数量增减不一;其中4mg/ mL 和20mg/ mL注射组CD8+数量下降，但100 mg/ mL注射组CD8+数量增加。

秃疮花内用针剂对小鼠淋巴细胞CD4和CD8的影响结果图：

图1 影响结果图1 图2 影响结果图2

注：图YJ-Y0：未标记的对照；图YJ-Y 1～图YJ-Y 4：分别为0mg/mL、4 mg/mL、20 mg/ mL和100 mg/ mL试验组在小鼠注射秃疮花7 d后小鼠淋巴细胞中CD4的含量；图YJ-Y 5～图YJ-Y 8：分别为0 mg/mL、4 mg/mL、20 mg/ mL和100 mg/ mL试验组在小鼠注射秃疮花7d，体外培养48 h后小鼠淋巴细胞中CD4的含量；图YJ-Y 9～图-YJ-Y 12：分别为0 mg/mL、4 mg/mL、20 mg/ mL和100 mg/ mL试验组在小鼠注射秃疮花7 d后小鼠淋巴细胞中CD8的含量(由于CD8细胞太少，几乎为0，word文档图为作者自己根据原流式图做的图。)；图YJ-Y 13～图YJ-Y 16：分别为0 mg/mL、4 mg/mL、20 mg/ mL和100 mg/ mL试验组在小鼠注射秃疮花7 d，体外培养48 h后小鼠淋巴细胞中CD8的含量。

表1 秃疮花内用针剂对小鼠淋巴细胞CD4和CD8的影响结果

2.2 讨论

从流式细胞仪测定秃疮花针剂对小鼠淋巴细胞CD4和CD8的影响结果看，小鼠腹腔注射秃疮花内用针剂7d后，与对照组相比，小鼠淋巴细胞CD4+数量明显下降，小鼠淋巴细胞CD8+数量明显增加;其中100 mg/mL注射组CD4+数量明显下降最多，20 mg/mL 注射组CD8+数量增加最多。这些试验数据说明，小鼠腹腔注射秃疮花内用针剂7 d后，小鼠机体免疫系统体液免疫水平在下降，但细胞免疫水平在明显提高。

分离秃疮花针剂处理的小鼠淋巴细胞，用ConA 刺激，5%CO2、37℃培养48 h后，与对照组相比，小鼠淋巴细胞CD4+数量明显下降，小鼠淋巴细胞CD8+数量增减不一;其中100 mg/mL注射组CD4+数量下降最大；4 mg/ mL 和20 mg/ mL注射组CD8+数量下降，但100 mg/ mL注射组CD8+数量增高。试验结果提示,秃疮花内用针剂处理7天后，小鼠淋巴细胞，用ConA 刺激，5%CO2、37℃培养48 h不是CD8+数量分泌的峰值期，但从100 mg/ mL注射组的数据能看出CD8+数量是在增加。这进一步说明，疮花针剂处理的小鼠淋巴细胞，在受到抗原刺激后，小鼠机体免疫系统体液免疫水平在下降，但细胞免疫水平在明显提高。

试验结果表明，秃疮花针剂对小鼠淋巴细胞有明显的调节功能，能提高小鼠的细胞免疫和调节体液免疫水平。从三个试验组数据看，100 mg/ mL注射组的效果是比较理想的，这为秃疮花制剂的临床应用积累了试验数据。