新疆伊犁地区不同动物源大肠杆菌耐药性调查

陈月月，王凯，王舒丰，姚晓慧，轩慧勇，马木尔，夏利宁

(1.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052；2.霍城县职业技术学校，新疆伊犁 835200)

0 引 言

【研究意义】兽医临床中致病性大肠杆菌常感染动物胃肠道，通过黏膜进入血液引起不同的疾病[1]，其危害严重，特别体现在禽类养殖业，给养殖户造成较大的经济损失。【前人研究进展】大肠杆菌病的防治主要依靠抗菌药物，因此，抗菌药物在治疗大肠杆菌病中有着无法替代的作用，但随着抗菌药物种类逐渐多样化和不规范的使用，导致大肠杆菌对很多药物产生耐药，甚至是多重耐药[2-3]。虽然世界上多个国家和组织都在不断研发新的抗菌药物来对抗细菌耐药性的问题，但耐药菌的产生速度远比研发新药速度快很多。【本研究切入点】新疆昼夜温差大，动物易发病，而大肠杆菌作为一种条件性致病菌，给养殖带来潜在的威胁，鲜见对新疆伊犁地区不同动物源大肠杆菌耐药性调查的报道。调查研究新疆伊犁地区不同动物源大肠杆菌耐药性。【拟解决的关键问题】采用琼脂稀释法，对新疆伊犁地区集约化养殖猪、散养养殖牛、羊、鸡粪源大肠杆菌进行耐药性调查，提高临床治疗效果的同时降低耐药菌产生的风险。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 样品采集

2016年10月在新疆伊犁地区霍城县采集粪样798份，其中包括牛粪样189份(1.5～2岁龄)、羊粪样200份(1～1.5岁龄)、鸡粪样300份(5～7月龄)和猪粪样100份(7～10月龄)，从中分离试验用大肠杆菌。

1.1.2 菌株和培养基

大肠杆菌ATCC25922标准菌株购自杭州天和微生物试剂有限公司。麦康凯培养基、普通肉汤和Mueller-Hinton(MH)培养基均购自北京奥博星生物技术有限公司。

1.1.3 药品

喹诺酮类：环丙沙星(含量100%)、诺氟沙星(含量99.6%)和恩诺沙星(含量100%)；氨基糖苷类：安普霉素(含量55.8%)、阿米卡星(含量65.5%)和庆大霉素(含量54.6%)；β-内酰胺类：阿莫西林(含量86.6%)/克拉维酸(含量100%)、头孢噻呋(含量100%)和氨苄西林(含量86.5%)；酰胺醇类：氟苯尼考(含量98%)。上述药物标准品均购自中国兽药监察所。

1.2 方 法

1.2.1 大肠杆菌分离鉴定

用灭菌棉签轻插入动物的肛门内，将沾有粪样的棉签放入内含1 mL灭菌营养肉汤的EP管中，37℃恒温培养12 h，将样液用接种环在麦康凯琼脂平板上划线，倒置于恒温培养箱内37℃培养18～24 h后，平板上生长出一致的粉红色菌落，挑取单菌落，经革兰氏染色及生化鉴定后，将确定为大肠杆菌的用灭菌含量为60%的甘油保菌，于-20℃冰箱保存。

1.2.2 药敏试验

按照临床实验室标准委员会(clinical and laboratory standards institute，CLSI)[4]推荐的琼脂稀释法来进行，对分离的大肠杆菌进行上述10种抗菌药物最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)的测定，以大肠杆菌ATCC25922作为质控菌株，结果判定参照CLSI标准以敏感、中介和耐药3种形式记录。表1

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌分离鉴定

四种动物源的大肠杆菌分离情况为，大肠杆菌分离率由高到低依次为羊源大肠杆菌(100%)、鸡源大肠杆菌(90.0%)、猪源大肠杆菌(89.0%)和牛源大肠杆菌(82.8%)。表2

表1 10种抗菌药物及ATCC25922质控范围的MICs结果判定标准Table 1 MICs results determination standard of 10 antibacterial agents and ATCC25922 quality control range(μg/mL)

表2 不同动物源大肠杆菌的分离率Table 2 The rate of Escherichia coli isolated from feces of different animals

2.2 不同动物源大肠杆菌对10种抗菌药物的耐药情况

不同动物源大肠杆菌对10种常见的抗菌药物的耐药结果为，猪源大肠杆菌对被检抗菌药物存在不同程度的耐药，尤其对氨苄西林(66.0%)、阿莫西林/克拉维酸(64.0%)、氟苯尼考(64.0%)和恩诺沙星(53.0%)4种抗菌药物，耐药率均超过50%；而对阿米卡星(100%)、安普霉素(92.0%)和头孢噻呋(91.0%)的敏感率均在90%以上。图1

牛源大肠杆菌对被检抗菌药物具有较好的敏感性，对安普霉素耐药率最高，仅为26.8%；对阿米卡星(98.8%)、氟苯尼考(95.1%)、环丙沙星(94.5%)、诺氟沙星(94.5%)、氨苄西林(91.5%)和恩诺沙星(91.4%)的敏感率均在90%以上，对头孢噻呋(100%)和庆大霉素(100%)完全敏感。图2

羊源大肠杆菌对阿莫西林/克拉维酸(77.5%)和氨苄西林(69.5%)2种抗菌药物的耐药率超过50%；对恩诺沙星(37.0%)和诺氟沙星(27.5%)的中介率相对较高；对阿米卡星(100%)、头孢噻呋(96.0%)、庆大霉素(72.5%)、氟苯尼考(65.5%)、环丙沙星(60.0%)和安普霉素(56.5%)6种抗菌药物的敏感率在55%以上。图3

图1 猪源大肠杆菌耐药情况
Fig.1 Resistance rate of Escherichia coli isolated from feces of piglets

图2 牛源大肠杆菌耐药情况
Fig.2 Resistance rate of Escherichia coli isolated from feces of cattle

图3 羊源大肠杆菌耐药情况
Fig.3 Resistance rate of Escherichia coli isolated from feces of sheep

鸡源大肠杆菌对氨苄西林(74.4%)、阿莫西林/克拉维酸(73.0%)、氟苯尼考(71.7%)、恩诺沙星(65.9%)和诺氟沙星(61.1%)5种抗菌药物耐药率超过60%；但对阿米卡星(92.6%)、安普霉素(74.8%)、庆大霉素(69.6%)和头孢噻呋(66.7%)这4种抗菌药物的敏感率在66%以上。图4

2.3 不同动物源大肠杆菌多药耐药情况

不同动物源大肠杆菌对临床常用抗菌药物多药耐药情况：牛源大肠杆菌多药耐药集中在0～5耐之间，以0耐(62.0%，102/164)和1耐(32.0%，52/164)为主，2耐、4耐和5耐的多药耐药百分比分别为1.0%、4.0%和1.0%；羊源大肠杆菌多药耐药在0～8耐分布，以4耐(16.0%，32/200)和6耐(16.0%，32/200)为主，其次是3耐(15.5%)和5耐(12.5%)；猪源大肠杆菌在0～8耐有分布，以0耐(16.0%，14/89)和5耐(13.0%，12/89)为主，其次是2耐(12.0%)、3耐(11.0%)、4耐(10.0%)和6耐(12.0%)；鸡源大肠杆菌多药耐药在0～10耐均有分布，以6耐(15.2%，41/270)和7耐(17.7%，48/270)为主，其次是8耐(14.4%)。图5

图4 鸡源大肠杆菌耐药情况
Fig.4 Resistance rate of Escherichia coli isolated from feces of chicken

图5 不同动物源大肠杆菌多药耐药情况
Fig.5 Comparison of multidrug resistance rates of Escherichia coli isolated from feces of different animals

3 讨 论

3.1 不同动物源大肠杆菌耐药情况

3.1.1 猪源大肠杆菌耐药情况比较

此次试验中猪源大肠杆菌对阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、氟苯尼考这3种抗菌药物的耐药百分率均超过60%，高于王基伟等[5]报道的猪源大肠杆菌对氨苄西林的耐药率为52.7%；但耐药结果低于岳秀英等[6]与张炳亮等[7]报道的猪源大肠杆菌对氨苄西林的耐药率，耐药率分别是91.2%和94.1%。不同地区猪源大肠杆菌对临床常用抗菌药物的耐药情况差异较大，如魏雅静[8]报道的四川省不同地区大肠杆菌对氨苄西林的耐药率为74.6%；黄健强等[9]报道的粤北地区仔猪腹泻大肠杆菌对氨苄西林的耐药率为85%，恩诺沙星的耐药率为67.5%；艾伟昌等[10]河南省猪源大肠杆菌对氨苄西林与氟苯尼考耐药率分别为85.4%和83.0%。猪源大肠杆菌耐药性日益严重，原因可能是因为猪疾病较多，特别在养殖过程中容易得大肠杆菌病，在治疗过程中使用抗菌药物多样化，导致猪源大肠杆菌耐药性复杂。

3.1.2 牛源大肠杆菌耐药情况

牛源大肠杆菌对被检抗菌药物耐药性几乎呈现敏感，对安普霉素耐药率最高，为26.8%，耐药率比轩慧勇等[11]报道的奎屯地区牛源大肠杆菌耐药率安普霉素(13.3%)高。牛作为一种大型的畜牧养殖动物，耐受性较好，一般能够以自身的免疫系统抵制疾病，就目前状况来看，本地区牛源大肠杆菌耐药情况不严重，但也不能轻视。

3.1.3 羊源大肠杆菌耐药情况

羊源大肠杆菌与猪源大肠杆菌耐药情况大体相同，主要对阿莫西林/克拉维酸和氨苄西林耐药，耐药率分别为77.5%和69.5%，耐药结果稍高于南海辰等[12]报道的羊源大肠杆菌对阿莫西林/克拉维酸(33.3%)与氨苄西林(45.8%)的耐药率，但耐药结果与刘正明等[13]报道的内蒙古羊源大肠杆菌对阿莫西林/克拉维酸耐药率(75%)大致相同。由于羊的样本采集较为困难，且缺少大型规模化羊养殖场，所以国内鲜见对羊大肠杆菌耐药性的研究，但试验结果显示，新疆伊犁地区羊源大肠杆菌对临床常用部分抗菌药物耐药结果严重，通过用药调查发现：养殖户或农牧民在应对羊大肠杆菌病时，也曾使用过较多抗菌药物进行治疗。因此，羊源大肠杆菌耐药性应该得到重视。

3.1.4 鸡源大肠杆菌耐药情况

试验鸡源大肠杆菌耐药性较为复杂，主要对氨苄西林(74.4%)、阿莫西林/克拉维酸(73.0%)、氟苯尼考(71.7%)、恩诺沙星(65.9%)和诺氟沙星(61.1%)5种抗菌药物耐药。其中氨苄西林与阿莫西林耐药率较高于李穗霞等[14]肉鸡源对阿莫西林/克拉维酸(66.0%)和氨苄西林(60.6%)的报道；与王影等[15]报道的鸡源大肠杆菌对氨苄西林(77.7%)耐药率相似，但氟苯尼考(55.6%)的耐药率略低于本试验；而本试验结果低于方杰[16]报道的鸡源大肠杆菌对氨苄西林(80.9%)与恩诺沙星(90.1%)的耐药率。以上报道显示，虽然不同地区鸡源大肠杆菌耐药结果存在差异，但均对被检临床抗菌药物耐药情况严重。鸡作为人类生活当中必不可少的禽类养殖动物，随着人类对鸡以及鸡产品需求量越来越大，鸡养殖也由散养进入集约化养殖，集约化养殖存在密度较大的原因，导致在鸡养殖过程中容易得大肠杆菌病，而鸡肉与鸡产品要求饲养周期短，所以在鸡大肠杆菌临床用药方面呈现多样化，耐药情况也越来越严重。

3.2 不同动物源多药耐药情况比较与分析

试验中牛源大肠杆菌多药耐药情况主要以0耐和1耐为主，与轩慧勇等[11]与南海辰等[12]报道的多药耐药结果大致相同，分离的猪源大肠杆菌与羊源大肠杆菌在0～8耐分布；但鸡源大肠杆菌在0～10耐均有分布，此次试验结果与赖婧等[17]报道的大肠杆菌多药耐药情况相比较为严重，但与邢艳苹等[18]多药耐药结果大致相似。以上研究结果表明，全国各地的不同动物源大肠杆菌都具有不同程度的耐药情况，其中对青霉素类和酰胺醇类抗菌药物的耐药率较高。

鸡源270株大肠杆菌对临床常用10种抗菌药物存在不同程度的多药耐药情况，多药耐药情况最为严重，分析原因可能为：鸡作为高密度和集中饲养的典范，在养殖过程中长期持续利用抗生素预防和治疗疾病，特别是该地区鸡养殖户在应对鸡的大肠杆菌病时，抗生素滥用情况突出；由于养殖场和兽医临床大量使用抗生素，大肠杆菌耐药谱逐渐扩大，耐药率逐渐上升，原本对大肠杆菌病治疗有效的抗菌药物疗效明显下降甚至丧失[19]，细菌在用药压力下可通过改变自身的代谢途径或耐药基因的突变，避免被药物抑制或杀灭，从而产生获得耐药性[20]。

4 结 论

新疆伊犁地区不同动物源大肠杆菌对临床常用抗菌药物存在不同程度耐药，整体耐药情况由高到低依次为鸡源大肠杆菌>猪源大肠杆菌>羊源大肠杆菌>牛源大肠杆菌；除牛源菌外，对氨苄西林和阿莫西林/克拉维酸耐药率超过64.0%，不同动物源分离的大肠杆菌对环丙沙星、头孢噻呋、阿米卡星和庆大霉素有较好的敏感性。在进行该地区大肠杆菌病临床用药时，可结合此根据不同动物源耐药情况合理用药，防止短期内耐药性与多药耐药的现象加重。