人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离培养的新方法*

唐书生，孙逊沙，吴洁莹，陆琰，陈劲松，李发涛，唐婕，吴韶清Δ

(1.广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心，广州 510623；2.中山大学附属广州市妇女儿童医疗中心，广州 510623；3. 中山大学附属第一医院，广州 510080)

1 引 言

间充质干细胞是一种来源于中胚层，具有多向分化潜能的成纤维样贴壁细胞，是组织工程研究中一种重要的种子细胞和基因治疗的载体，已成为干细胞临床转化应用研究的热点[1-3]。目前已经从骨髓、脂肪、牙髓、羊膜、绒毛膜、蜕膜、脐带、脐血、睾丸、扁桃体等组织中分离培养出间充质干细胞[4-6]，但是如何体外简便、快捷分离培养原代间充质干细胞是获得间充质干细胞研究材料的关键。本研究旨在建立一种分离培养hpcMSCs的新方法，力求简化操作、提高效率，为进一步探讨间充质干细胞的应用提供基础。

2 材料与方法

2.1 材料

经医院伦理委员会批准，征得产妇和家属书面知情同意的情况下，在广州市妇女儿童医疗中心产科获取剖宫产健康足月的新生儿胎盘，胎盘无老化钙化，孕妇的乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV、梅毒等传染性感染性疾病检测为阴性。

2.2 试剂和设备

StemPro MSC SFM CTSTM培养基(美国Gibco公司)，胰蛋白酶(美国Gibco公司)，胶原酶Ⅱ(美国Gibco公司)，无RNA酶的DNA酶(美国Promega)，细胞茜素红染色试剂盒(中国纽杰美公司)，油红O染色试剂盒(中国南京建成)，成骨、成脂诱导分化试剂盒(美国Gibco公司)，CCK-8检测试剂盒(日本同仁公司)，流式细胞仪及标记抗体(美国BD公司)，CO2培养箱(德国Lab公司)，手持电动匀浆器(美国PRO Scientific公司)，倒置显微镜(日本NIKON公司)。

2.3 实验方法

2.3.1hpcMSCs的分离培养 将产房获得的胎盘置于无菌盒中，加入500 ml生理盐水，并转运至GMP实验室。无菌状况下，撕去胎盘的羊膜，用剪刀剪取胎盘绒毛膜，并剪成1cm左右条块状，用镊子挤压，同时用生理盐水反复冲洗至澄清，用镊子挤压干净血液和水份后，用电子天平称量，获得绒毛膜湿重。然后加入适量生理盐水，用手持电动匀浆器处理至细小颗粒状(约米粒大小)，再次用生理盐水反复冲洗至澄清，接着继续用匀浆器处理至肉糜状(稍有颗粒感，能够用吸管自由吸取)；离心500 r/min，5 min，去除上清液，沉淀中加入同体积的胰蛋白酶和胶原酶Ⅱ，于37℃，消化0.5～3 h。用生理盐水洗涤两次后，加入培养基，按照每10 g绒毛膜组织接种一T75培养瓶的份量进行接种。然后置于饱和湿度、37℃、体积分数为5%CO2的培养箱中静止培养7 d后，置倒置显微镜下观察并记录细胞状态。倒出培养液，并用少量生理盐水冲洗培养瓶底，重新加入新鲜培养基。待培养瓶中，细胞生长到80%～90%融合状态时，用胰蛋白酶消化后按1∶2传代。

2.3.2hpcMSCs的形态学观察 除接种后静止培养7 d，每日在倒置显微镜下观察hpcMSCs的形态并拍照。

2.3.3流式细胞术检测hpcMSCs的表面标记 取P3代细胞，分别加入流式抗体CD45、CD34、CD90、CD105、CD73、CD14、CD19、HLA-DR和同型对照抗体10 ul，混匀后避光室温孵育30 min，用PBS洗涤2次(1500 r/min，5 min)，重悬后进行流式细胞术检测和分析。

2.3.4测定细胞生长曲线 取P3代细胞，用培养基吹打成单细胞悬液，以2×104/cm2接种于96孔板上，设置7组，每组7孔，置于饱和湿度、37℃、体积分数为5%CO2的培养箱中培养，每隔24 h，任意选择一组，加入10 ul CCK-8溶液，酶标仪检测各组细胞吸光度值(激发波长450 nm)，用无细胞的培养基做空白对照，连续7 d，每天取7孔的吸光度均值绘制生长曲线。

2.3.5hpcMSCs成骨、成脂诱导分化潜能鉴定 取P3代细胞，接种于24孔培养板，当细胞生长到80%融合度时，换成成骨或成脂诱导培养基，再分别诱导培养四周后，用茜素红染色试剂盒检测成骨诱导分化，用油红O染色试剂盒检测成脂诱导分化，分别用未加诱导分化培养基进行对照。倒置显微镜下观察分析和拍照。

3 结果

3.1 hpcMSCs分离、接种和培养

从接收标本到完成接种培养，一个胎盘绒毛膜能够在一个工作日内处理完成，胎盘绒毛膜经处理后，离心后的沉淀中，没有明显的红细胞。按照每10 g绒毛膜组织接种一T75培养瓶的份量进行接种，接种后，静止培养7 d后全量换液。

3.2 hpcMSCs的形态

初次换液时，可见细胞呈散在分布的贴壁生长，部分细胞为单个或几个细胞一起贴壁生长，有的细胞刚从组织块中爬伸出来。细胞为长梭形，有胞浆突起，少数为多角形。传至P3代，细胞形态较均一，成平行排列或漩涡状的成纤维细胞样形态(见图1)。

3.3 hpcMSCs免疫表型

流式细胞术检测P3代人胎盘源绒毛膜间充质干细胞(见图2)，均高表达CD90、CD105、CD73，阴性表达CD34、CD45、CD14、CD19、HLA-DR。

图1hpcMSCs的形态(×50)

Fig1MorphologyofhpcMSCs(×50)

图2hpcMSCs的免疫表型

Fig2ImmunophenotypeofhpcMSCs

3.4 hpcMSCs生长曲线

CCK-8法绘制P4代人胎盘源绒毛膜间充质干细胞的生长曲线，1～2 d间充质干细胞处于潜伏期，增殖不明显；3～5 d细胞进入对数生长期，细胞增殖加速；6～7 d细胞进入平台期，生长缓慢(见图3)。

3.5 hpcMSCs诱导分化潜能鉴定

P4代人胎盘源绒毛膜间充质干细胞经成脂、成骨分化培养基诱导4周后，分别用茜素红或油红O染色(见图4)。

图3hpcMSCs生长曲线

Fig3GrowthcurveofhpcMSCs

图4hpcMSCs诱导分化检测(×200)

(A).表示成脂诱导分化；(B).表示成骨诱导分化

Fig4InducingdifferentiationofhpcMSCs(×200)

(A).AdipogenicdifferentiationofhpcMSCswasobservedundermicroscope; (B).OsteogenicdifferentiationofhpcMSCswasobservedundermicroscope

4 讨论

二十世纪七十年代，Friedenstein等首先从成人骨髓中分离培养出间充质干细胞，随着研究的深入，表明间充质干细胞具有分化能力强，倍增时间短，具有免疫调节作用和低下的免疫原性，易于转染的特性，是再生医学的一种理想种子细胞和基因治疗载体[7-9]。而hpcMSCs比骨髓来源MSC更原始，免疫原性更低，受到再生医学领域的广泛关注[2,10]。

目前，hpcMSCs分离培养方法主要有组织块法和胰蛋白酶消化法，整个过程操作繁琐，容易污染，而且用胰蛋白酶处理时间太长，影响细胞活性和传代能力[11]。本方法中，(1)只需用手工把绒毛膜组织剪成1～3 cm的小条块，减少了人力的消耗和时间成本，一个工作日内完全可以处理完一个完整胎盘的绒毛膜。(2)用手持电动匀浆器处理至细小颗粒状(约米粒大小)，用生理盐水反复冲洗，能够去除大部分胎血，再继续用匀浆器处理至肉糜状(稍有颗粒感，能够用吸管自由吸取)；离心500 r/min，5 min，去除上清液。通过这个处理过程，基本上能够去除胎血及其中的红细胞。(3)用匀浆器处理后，组织块变得很薄而且微小，增加了组织块的分散度，提高了接种面积。(4)匀浆器处理后，组织成肉糜状，减少了胰蛋白酶的消化时间，避免了对细胞的伤害。(5)接种前的沉淀为浆糊状，组织块相互粘连，使得加入培养基后不易漂浮，使得微小组织能够有比较好的贴壁效果。新方法基本上结合了酶消化法和组织块贴壁法的优点。

由于胎盘组织具有独特、复杂的解剖结构，其内有大量交错的血管网络及结缔组织，导致胎盘来源间充质干细胞不纯，为胎盘血间充质干细胞和胎盘组织间充质干细胞的混合物。而且大量红细胞的存在，也是胎盘间充质干细胞分离提取的障碍，阻止原代间充质干细胞的有效贴壁，减少原代间充质干细胞的数量或培养不成功[12-14]。本方法中，用匀浆器处理绒毛膜至米粒大小时，进行冲洗，能够去除大部分胎血，处理至乳糜状态时，再一次低速离心，使得胎血细胞保存在上清液中，有效去除了胎血细胞，减少了红细胞对间充质干细胞贴壁的影响，提高了P0代细胞的均一性。整个过程简便，不用增加新的试剂和处理程序，减少了污染可能。

本方法中，选用手持电动匀浆器作为一种基本实验器材的原因如下：(1)易得：匀浆器基本功能是用于组织匀浆，方便提取细胞DNA，生物医学实验室普遍具有该器材，如果没有，购买方便而且便宜，普通实验室完全有能力购买。(2)方便：电动匀浆器使用方便，器材主体可以随意移动和消毒，电动匀浆器的转子可以进行灭菌处理。(3)过程容易掌握：整个过程肉眼可见，随时调整处理程度。

综上，新的hpcMSCs分离培养方法是结合了胰蛋白酶消化法和组织块贴壁培养法的优点。该体系简便、快捷，提高了原代hpcMSCs的产量，为建立临床级hpcMSCs库奠定基础，可以为组织工程和基因治疗载体提供足够的、质量稳定可靠的间充质干细胞。