亮菌多糖的单糖组成分析及含量测定方法

蔡晶晶，王雅洁，王 蔷，宋小平

(安徽医学高等专科学校药学系，安徽合肥 230601)

亮菌因菌丝体能在暗处发出浅蓝色的荧光而得名，属于担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，口蘑科，假蜜环菌属，为一种药食兼用的名贵食用菌[1]。亮菌营养丰富，具有良好的药用价值，具有提高免疫力、抗肿瘤、消炎、抗菌、防辐射等作用。中医认为亮菌味甘性寒，具有强筋壮骨、疏风活络、名目利肺、益肠胃等保健功能[2-3]。临床上常用的亮菌口服液是以亮菌为原材料开发的。亮菌口服液主要成分之一即为亮菌多糖，具有提高免疫功能，抗氧化、抗衰老，预防心脑血管疾病，逆转酒精导致的肝损伤，促进核酸、蛋白质的生物合成和组织损伤修复等功效[4]。

亮菌多糖含量测定既为亮菌口服液、亮菌糖浆制剂的质控标准之一，也是亮菌多糖活性研究中的基本内容。亮菌多糖成分复杂，由多种单糖组成，由于不同单糖与化学试剂的显色深度不同，采用不同单糖为标准品绘制的标准曲线的斜率也不同[5]。如葡萄糖、阿拉伯糖显色最深，甘露糖、木糖较浅，半乳糖、岩藻糖显色更浅。在测定多糖混合物时，因单糖组成不同造成误差，导致样本测定结果因标准品而异，可信度低。本文拟分析亮菌多糖的单糖组成，评估适当的单糖标准品以替代目前国标中的葡萄糖标准品，采用硫酸-苯酚法测定多糖含量，以期得到更为科学的亮菌多糖测定方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200液相色谱仪(美国安捷伦公司)、美谱达UV-1100紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)。

亮菌固体发酵菌由合肥诚志生物制药有限公司提供。单糖标准品鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)、核糖(Rib)、岩藻糖(Fuc)、葡萄糖醛酸(GlcUA)，半乳糖醛酸(GalUA)标准品均为sigma公司产品；乙腈为色谱纯；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮、三氟乙酸、甲醇、氢氧化钠、盐酸、硫酸、磷酸氢二钾、苯酚等试剂均为国产分析纯。

1.2 亮菌多糖的制备

取亮菌固体发酵菌，加水80℃提取2 h，过滤取上清液，减压浓缩至1/3体积后，加三倍体积95%乙醇，4℃静置12 h后，3000 rpm离心10 min，弃去上清液，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤三次，3000 rpm离心10 min，取沉淀。沉淀用水溶解后，真空冷冻干燥。取适量亮菌多糖冻干粉用水溶解制成浓度为2%的溶液，用Sevag法去除亮菌粗多糖中的蛋白质，共去除5次，再经活性炭脱色，得亮菌多糖溶液，经真空冷冻干燥，冻干粉保存。

1.3 亮菌多糖的组成分析

采取1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生高效液相色谱法测定亮菌多糖组成[6-7]。以鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、核糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸十种单糖的混合对照品溶液同法处理做对照。精密称定适量亮菌多糖冻干粉于100 mL锥形瓶中，加入4 mol·L-1的三氟乙酸溶液1.0 mL，置120℃条件下水解120 min。70℃水浴，氮吹仪吹干。向水解干燥后得到的样品及上述混合对照品溶液中分别加入0.5 mol·L-1的PMP甲醇溶液和0.3 mol·L-1的NaOH溶液各0.5 mL，充分混匀后，水浴70℃，反应30 min。冷却至室温后加入0.3 mol·L-1HCl 0.5 mL中和，充分混匀。再加入1 mL氯仿，充分振荡萃取，去除氯仿层，共萃取三次。水层用0.22 μm的滤膜滤过后，待上机。

2 结果与分析

2.1 色谱条件及结果

色谱条件如下：色谱柱：Thermo C18柱(4.6×250 mm，5 μm)；流动相为0.1 mol·L-1pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液∶乙腈=82∶18(v/v)；流速为1.0 mL/min；柱温为25℃；进样量为10 μL；检测波长为245 nm。

1.Man 2.Rib 3.Rha 4.GlcUA 5.GalUA 6.Glc 7.Gal 8.Xyl 9.Ara 10.FucA.混合标准品的PMP衍生产物HPLC图；B.亮菌多糖的PMP衍生产物HPLC图图1 混合标准品和亮菌多糖的PMP衍生产物HPLC色谱图

通过与标准图谱比较发现，亮菌多糖主要由六种单糖组成，结合各标准糖的峰面积，采用外标法计算出亮菌多糖中组成糖的含量分别为：甘露糖9.65%、葡萄糖42.72%、半乳糖25.60%、木糖9.81%、阿拉伯糖6.64%、岩藻糖3.94%。另两种单糖含量非常低，分别为核糖与葡萄糖醛酸，两者共占1.64%。

2.2 硫酸-苯酚法测定多糖含量

2.2.1 硫酸-苯酚法测定标准曲线

精密称取无水萄葡糖(Glc)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、岩藻糖(Fuc)各10 mg，加水溶解定容至100 mL，摇匀，即得到0.1 mg·mL-1的标准单糖溶液。混合标准单糖溶液则按照1.3中检测的各种亮菌单糖的质量组成比例配制成浓度为0.1 mg·mL-1的混合标准单糖溶液。采用硫酸-苯酚法测定[5]，分别精密量取0.1 mg·mL-1的标准糖溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL置具塞试管中，依次添加水至2.0 mL，以2.0 mL水为空白对照。各管加入5%苯酚1 mL，摇匀后，迅速加入浓硫酸5.0 mL，立即摇匀，置40℃水浴中保温30 min，取出于冰浴中放置5 min，测定490 nm处的吸光值。

主要几种单糖的标准曲线如图2所示。

图2 各种单糖及混合糖的硫酸-苯酚法标准曲线

依据混合糖标准曲线，回归方程为y=13.134x-0.0332(0.02～0.07 mg·mL-1),相关系数R2=0.9994，方程拟合度良好。从标准曲线及依据不同标准曲线的测定值可以得出，以甘露糖做标准曲线所计算的结果与混合标准单糖最为接近。

2.2.2 不同标准曲线下的亮菌多糖含量

精密称定1.2中制备的亮菌多糖冻干粉10 mg，蒸馏水溶解定容至100 mL，取出25 mL，再定容至50 mL后做亮菌多糖供试液，该亮菌多糖供试液理论浓度为0.05 mg·mL-1。

取亮菌多糖供试液2 mL，参照2.2.1标准曲线中检测方法，采用不同标准品计算得到的多糖浓度与供试液理论浓度0.05 mg·mL-1的比值如表1所示。

表1 不同标准品制作标准曲线测得亮菌多糖含量结果

2.2.3 精密度实验

取0.1 mg·mL-1的混合标准单糖溶液稀释两倍后，取出2 mL，参照2.2.1标准曲线中检测方法，连续测定6次，结果RSD为0.22%。

2.2.4 重复性实验

取2.2.2中亮菌多糖供试液6份，每份2 mL，参照2.2.1标准曲线中检测方法，考查方法的重复性。结果RSD为1.72%，表明方法重复性良好。

2.2.5 稳定性考查

取2.2.2中亮菌多糖供试液3份，每份2 mL，参照2.2.1标准曲线中检测方法，分别在反应结束后的10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、90 min、120 min、150 min进行490 nm处吸光度的测定，RSD值分别为0.97%、1.12%、1.54%，表明数值在150 min内稳定。

2.2.6 回收率实验

以混合标准单糖为对照，硫酸-苯酚法测定亮菌多糖的含量。取亮菌多糖溶液样本适量与混合标准单糖按表2所示的量混合，不足部分用水补充体积至2 mL，参照2.2.1标准曲线中检测方法，测定含量，计算回收率。结果平均回收率为102.38%，RSD为2.73%。

表2 回收率实验结果

3 讨论

多糖常用的测定方法有硫酸-苯酚法与硫酸-蒽酮法，经实验对比发现两种方法的稳定性、重现性均较好，但相较于硫酸-苯酚法，在应用过程中硫酸-蒽酮法有以下不足：一是反应条件需要煮沸，且所用的硫酸是强腐蚀性试剂，煮沸环节增加了实验的安全风险和管理风险；二是测定吸光值时，硫酸-蒽酮与糖反应产物附着在玻璃比色皿壁，清洗时需用乙醇浸泡才能去除反应残留物，这增加了洗涤难度和成本。同时，硫酸-蒽酮法测定的是样本中所有的碳水化合物，易受样本中蛋白质等非多糖化合物的干扰，而硫酸-苯酚法用于多种糖类的显色反应，且基本不受蛋白质杂质的影响，因此用于多糖测定具有更高的专属性[8-9]。

硫酸-苯酚法来测定亮菌多糖含量原理为多糖会在浓硫酸的作用下水解成单糖，再脱水形成呋喃环结构的糠醛衍生物，糠醛衍生物可与苯酚等物质反应生成有色化合物，因此选择与样品的单糖组成相近的标准品对含量测定结果至关重要。而亮菌糖浆制剂大多为亮菌固体发酵多糖制剂，单糖成分复杂，含量尚未见文献报道，需要进一步研究多糖含量测定方法。

本文采用PMP-HPLC方法测定了亮菌糖浆中的单糖组成，得出其单糖组成主要由葡萄糖(42.72%)、半乳糖(25.60%)、木糖(9.81%)、甘露糖(9.65%)、阿拉伯糖(6.64%)、岩藻糖(3.94%)构成。用HPLC法也可以建立各种单糖的含量测定线性方程，分别测定各个单糖含量，方法可靠但过程繁琐。本实验进一步选择硫酸-苯酚法进行亮菌多糖含量测定，以方便在实验室批量检测或工业应用。实验表明硫酸-苯酚法测多糖含量时在0.02～0.07 mg·mL-1范围线性关系良好，加标准品的回收率高。

同种亮菌粗多糖样品，分别采用上述6种含量较高的单糖及按单糖比例组成的混合物为标准品，检测结果表明，以岩藻糖做标准曲线，测得样本中多糖含量值大于200%，以半乳糖为标准品则大于100%，以甘露糖为标准品测得值为75.41%，按照单糖组成比例的混合标准品做曲线测得值为74.95%，与以甘露糖为标准曲线的结果基本一致。而以葡萄糖为标准品测得的多糖值最低，为56.24%。因此，采用传统方法中的葡萄糖作为标准品会低估样本中的多糖含量。依据亮菌多糖的单糖组成比例制备混合标准品测定总糖含量更为准确，但是混合标准品配制繁琐，也可用甘露糖作为标准品。用甘露糖或者混合单糖制作标准曲线，结合硫酸-苯酚法可以较为准确地检测亮菌多糖的含量，实验结果表明，该法的重复性好、精密度高、颜色稳定时间长，测定亮菌多糖含量准确、可靠。