甜瓜抵抗链格孢侵染能力差异 与活性氧相关代谢的关系

李 梦,冯作山,玛尔哈巴·帕尔哈提,张明明,王海瑞,夏 璇,白羽嘉

(新疆农业大学食品科学与药学学院,新疆乌鲁木齐 830052)

厚皮甜瓜为新疆特色经济作物,由于产期正值高温夏季,加之缺乏有效保鲜处理和必要冷链贮运,使得采后腐烂颇为严重,造成巨大的经济损失[1]。多种真菌与厚皮甜瓜采后腐烂有关,链格孢菌(Alternariaalternata)引起的黑斑病是导致采后甜瓜腐烂的重要原因[2]。

伽师瓜和86-1甜瓜是新疆特色厚皮甜瓜,前者为晚熟品种,耐贮运;后者为中晚熟品种,耐藏性一般[3]。两种甜瓜肉质松脆,甘甜爽口,果肉颜色相近,呈橘红色;果皮存在较大差异,伽师瓜果皮致密无网纹或少网纹,为墨绿色;86-1甜瓜果皮富集网纹,为黄色,夹杂绿色条纹。研究发现，链格孢侵染伽师瓜和86-1甜瓜第0～14 d,果实未出现明显病斑,但在侵染中后期,病斑迅速扩大,86-1甜瓜病斑大于伽师瓜[4]。两种甜瓜对病原菌侵染的抵抗能力存在差异,果皮是果实抵御病原菌侵染的第一道防线[5],推测侵染前期果皮有效阻止了病原菌的侵染,中后期病原菌突破果皮的防御,果肉抵御能力较弱,病原菌在果肉中大量繁殖,病斑直径迅速扩大。

近年来对甜瓜采后病害的研究多有报道,但是主要集中在采用草酸、硅酸钠、水杨酸、壳聚糖、苯并噻重氮、一氧化氮等处理研究甜瓜果肉的层面[7，11-15]。对甜瓜自身抵抗病原菌侵染的研究相对不足,且对甜瓜与甜瓜组织(果皮与果肉)抗病性差异研究较少。本研究以伽师瓜和86-1甜瓜果实为试验材料,接种链格孢,测量贮藏期间果皮与果肉病斑大小,分析活性氧相关代谢的变化规律,研究甜瓜与甜瓜组织抵抗病原菌侵染能力差异与活性氧相关代谢的关系,为甜瓜采后病害的控制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

伽师瓜(卡拉克塞) 采摘于新疆喀什地区伽师县,选取可溶性固形物≥14%,单果重(3.5±0.5) kg,无病虫害、无机械损伤的果实;86-1甜瓜 采摘于新疆喀什地区伽师县,选取可溶性固形物≥15%,单果重(3.8±0.5) kg,无病虫害、无机械损伤的果实;链格孢菌 由新疆农业大学食品科学与药学学院微生物实验室提供,分离自伽师瓜自然发病的果实,PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)4 ℃斜面保存;冰醋酸、丙酮、无水醋酸钠、聚乙二醇6000、聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、邻苯二酚、愈创木酚、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、二硫苏糖醇(DTT)、甲硫氨酸、氮蓝四唑(NBT)、核黄素、浓氨水、硫酸、盐酸、30% H2O2、Triton X-100、EDTA-Na2等 均为分析纯(AR),购自天津市光复精细化工研究所。

FA2104N型电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司;NBCJ-B型无菌操作台、MHP-250型恒温培养箱 上海鸿都电子科技有限公司;LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;TGL-16G型高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂;TU-1810型紫外-可见分光光度计 北京普析通用公司;FE20型pH计 梅特勒-托利多仪器有限公司;XSP-2C型显微镜 上海蔡康光学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 损伤接种与取样 链格孢接种PDA固体培养基,28 ℃培养7 d,收集孢子。用含有0.01% Tween-80的无菌水配制浓度为1×106个/mL孢子悬浮液。整颗甜瓜用2%过氧化氢清洗表面，并浸泡30 s进行消毒,清水冲洗干净后晾干,7 ℃预冷。在甜瓜果实赤道等距刺孔6个(直径3.5 mm),深度为5 mm,接种20 μL上述孢子悬浮液,对照组接入等量的无菌水。接种后,置于7 ℃、相对湿度85%～90%的冷库贮藏。

分别于0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 d取甜瓜病斑周围5 mm处的果皮与果肉组织(对照取接种处周围5 mm组织),每次随机选取9个甜瓜进行取样,液氮速冻,-80 ℃保存。

1.2.2 病斑直径的测量 在接种链格孢部位将甜瓜果实纵向剖开,测定果实过敏反应组织,每次测定6个果实,计算平均值,即为病斑直径。

1.2.3 H2O2含量的测定 参照曹建康等[16]的方法,计算每克鲜质量果蔬组织中过氧化氢的含量,结果以μmol·g-1FW表示。

1.2.5 丙二醛(MDA)含量的测定 参照李合生等[17]的方法,结果以nmol·g-1FW表示。

1.2.6 PPO活性的测定 参照曹健康等[16]的方法,以每克鲜重果蔬样品每分钟吸光度变化值增加1时为1个活性单位(U),结果以U·g-1FW表示。

1.2.7 POD活性的测定 参照曹健康等[16]的方法,以每克鲜重样品每分钟吸光度变化值增加1时为1个活性单位(U),结果以U·g-1FW表示。

1.2.8 SOD活性的测定 采用NBT方法[16]。以每分钟每克鲜重组织的反应体系对氮蓝四唑(NBT)光化还原的抑制为50%时为一个SOD活性单位(U),结果以U·g-1FW表示。

1.2.9 CAT活性的测定 参照Ren等[18]的方法,以每克鲜重组织每分钟OD值变化0.01为1 U,用U·g-1FW表示。

1.3 数据分析与作图

采用SPSS 19.0软件对实验数据进行处理分析,Origin 8.5软件绘图。

2 结果与分析

2.1 链格孢侵染甜瓜果实病斑直径的变化

链格孢侵染甜瓜第9 d,果皮与果肉出现病斑,并随贮藏时间呈不断扩大的趋势,果肉的病斑直径大于果皮。第30 d,伽师瓜和86-1甜瓜接种果肉病斑直径分别是伽师瓜和86-1甜瓜接种果皮的1.31、1.33倍,且差异极显著(p<0.01)。并且86-1甜瓜接种果皮与接种果肉病斑直径分别是伽师瓜接种果皮与接种果肉的1.28、1.30倍,且差异极显著(p<0.01)(图1A)。从第15 d开始,86-1甜瓜接种果皮与接种果肉的病斑扩展速度分别大于伽师瓜接种果皮与接种果肉(图1B)。原因可能是，86-1甜瓜果皮与果肉的结构与组分更适合链格孢菌的生长繁殖。

图1 链格孢侵染甜瓜果实病斑直径(A) 和病斑直径变化量(B)的变化Fig.1 Change in lesion diameter(A)and lesion diameter’s amount(B)of muskmelon fruit inoculated with A.alternata

2.2 链格孢侵染对甜瓜果实活性氧产生的影响

2.2.1 对H2O2含量的影响 贮藏伽师瓜前9 d,接种组果皮与果肉的H2O2含量显著高于对照组果皮与果肉(p<0.05),贮藏第12 d后,接种组果皮与果肉的H2O2含量始终低于对照组。接种组果皮与果肉的H2O2含量在第9 d达到峰值,对照组果皮与果肉H2O2含量在第12 d达到峰值,第9 d接种组果皮与果肉的H2O2含量峰值分别是第12 d对照组果皮与果肉峰值的1.27、1.25倍,且差异极显著(p<0.01)。且第9 d接种果皮的H2O2含量峰值是同一天接种果肉含量峰值的1.79倍,且差异极显著(p<0.01)(图2A)。

贮藏86-1甜瓜前9 d,接种组果皮与果肉的H2O2含量显著高于对照组(p<0.05),并在贮藏第12 d后,接种组果皮与果肉H2O2含量始终低于对照组。贮藏第9 d,接种组果皮与果肉的H2O2含量达到峰值,对照果皮H2O2含量在第9 d达到峰值,而对照果肉H2O2含量在第15 d达到峰值。第9 d接种组果皮与果肉的H2O2含量峰值分别是对照组第9 d果皮与第15 d果肉峰值的1.42倍,且差异极显著(p<0.01)和1.12倍,差异显著(p<0.05)。接种果皮的H2O2含量峰值是接种果肉含量峰值的1.76倍,且差异极显著(p<0.01)(图2B)。

图2 链格孢侵染对伽师瓜(A) 和86-1甜瓜(B)H2O2含量的影响Fig.2 Effects of A. alternata infection on H2O2 content of Jiashi(A)and 86-1 muskmelon(B)fruit

在贮藏期间,两种甜瓜果皮与果肉的H2O2含量呈现先升高后降低的变化趋势,甜瓜接种果皮与对照果皮的H2O2含量均分别高于甜瓜接种果肉与对照果肉。伽师瓜第9 d接种组果皮与果肉的H2O2含量峰值分别是86-1甜瓜第9 d接种组果皮与果肉含量峰值的1.40、1.38倍,且差异极显著(p<0.01)。原因是链格孢侵染初期,甜瓜爆发ROS用来防御链格孢菌的侵染。侵染中后期H2O2含量下降,是由于ROS清除酶的作用,防止ROS含量过高对甜瓜果实的进一步伤害,这与苹果、桃、枇杷等果实采后病害的研究结果一致[19-21]。

图3 链格孢侵染对伽师瓜(A) 和86-1甜瓜产生速率的影响Fig.3 Effects of A. alternata infection on production rate of Jiashi(A)and 86-1 muskmelon(B)fruit

2.3 链格孢侵染对甜瓜果实MDA含量的影响

植物在逆境下遭受伤害与ROS积累诱发的膜脂过氧化程度密切相关,MDA含量的高低反映细胞膜脂过氧化的程度[22]。链格孢侵染伽师瓜第30、24 d,接种果肉与接种果皮的MDA含量达到峰值,接种果肉MDA含量峰值是接种果皮含量峰值的2.42倍,且差异极显著(p<0.01)(图4A)。

链格孢侵染86-1甜瓜第27 d,接种果肉与接种果皮的MDA含量达到峰值,接种果肉MDA含量峰值是接种果皮含量峰值的1.41倍,且差异极显著(p<0.01)(图4B)。

图4 链格孢侵染对伽师瓜(A) 和86-1甜瓜(B)MDA含量的影响Fig.4 Effects of A. alternata infection on MDA content of Jiashi(A)and 86-1 muskmelon(B)fruit

在贮藏期间,两种甜瓜果皮与果肉的MDA含量整体呈现缓慢升高的变化趋势,接种组甜瓜果皮与果肉的MDA含量均分别低于对照组果皮与果肉,接种组与对照组的甜瓜果肉的MDA含量显著高于对应的接种组与对照组甜瓜果皮(p<0.05)。86-1甜瓜在第27 d，接种组果皮与果肉的MDA含量峰值分别是伽师瓜第24 d接种果皮与第30 d接种果肉MDA含量峰值的1.98、1.19倍,且差异极显著(p<0.01)。说明86-1甜瓜果皮与果肉的细胞膜脂过氧化的程度高于伽师瓜果实,86-1甜瓜果皮与果肉的病害较伽师瓜果皮与果肉严重,伽师瓜具有较完整的膜系统,与病斑直径的研究一致。

2.4 链格孢侵染对甜瓜果实活性氧代谢相关酶活性的影响

2.4.1 对PPO活性的影响 PPO能利用O2催化酚类物质，氧化成对病原菌有毒害作用的醌类物质,抵御病原菌的侵入[23]。链格孢侵染伽师瓜第21、18 d,接种果皮与接种果肉的PPO活性达到峰值,接种果皮PPO活性峰值是接种果肉活性峰值的2.00倍,且差异极显著(p<0.01)(图5A)。

链格孢侵染86-1甜瓜第18、21 d,接种果皮与接种果肉的PPO活性达到峰值,接种果皮PPO活性峰值是接种果肉活性峰值的1.41倍,且差异极显著(p<0.01)(图5B)。

图5 链格孢侵染对伽师瓜(A) 和86-1甜瓜(B)PPO活性的影响Fig.5 Effects of A. alternata infection on PPO activity of Jiashi(A)and 86-1 muskmelon(B)fruit

在贮藏期间,两种甜瓜果皮与果肉的PPO活性整体呈现先升高后下降的变化趋势,接种组甜瓜果皮与果肉的PPO活性均分别显著高于对照组果皮与果肉(p<0.05),接种组与对照组的甜瓜果皮PPO活性均分别显著高于接种组与对照组甜瓜果肉(p<0.05)。伽师瓜第21 d接种果皮与第18 d接种果肉的PPO活性峰值分别是86-1甜瓜第18 d接种果皮与第21 d接种果肉活性峰值的1.60倍,差异极显著(p<0.01)和1.12倍,差异显著(p<0.05)。

2.4.2 对POD活性的影响 POD能通过氧化酚类物质分解H2O2,并且能与SOD、CAT相互协调配合,清除过多的ROS,使体内自由基维持动态平衡,提高植物的抗病性[25]。贮藏伽师瓜第24 d,接种果皮与对照果皮的POD活性达到峰值,接种果皮的POD活性峰值是对照果皮活性峰值的1.16倍,且差异极显著(p<0.01)(图6A)。

贮藏86-1甜瓜第21 d,接种果皮与对照果皮的POD活性达到峰值,接种果皮的POD活性峰值是对照果皮活性峰值的1.26倍,且差异极显著(p<0.01)(图6B)。

图6 链格孢侵染对伽师瓜(A) 和86-1甜瓜(B)POD活性的影响Fig.6 Effects of A. alternata infection on POD activity of Jiashi(A)and 86-1 muskmelon(B)fruit

在贮藏期间,两种甜瓜接种果皮与对照果皮的POD活性整体呈现先升高后下降的变化趋势,而甜瓜接种果肉与对照果肉的POD活性几乎无变化,说明甜瓜果皮POD活性发挥主要抵御链格孢的作用。接种甜瓜果皮的POD活性均显著高于对照果皮(p<0.05),接种果皮与对照果皮的POD活性均分别极显著高于接种果肉与对照果肉(p<0.01)。伽师瓜第24 d接种果皮的POD活性峰值是86-1甜瓜第21 d接种果皮活性峰值的1.60倍,且差异极显著(p<0.01)。

图7 链格孢侵染对伽师瓜(A) 和86-1甜瓜(B)SOD活性的影响Fig.7 Effects of A. alternata infection on SOD activity of Jiashi(A)and 86-1 muskmelon(B)fruit

贮藏86-1甜瓜第24 d,接种果皮与对照果皮的SOD活性达到峰值。第24 d,接种果皮的SOD活性峰值是对照果皮活性峰值的1.52倍,且差异极显著(p<0.01)(图7B)。

在贮藏期间,两种甜瓜接种果皮与对照果皮的SOD活性整体呈现先升高后下降的变化趋势,而接种果肉与对照果肉的SOD活性几乎无变化,说明果皮SOD活性发挥主要抵抗链格孢侵染的作用,同POD。接种果皮的SOD活性均显著高于对照果皮(p<0.05),接种果皮与对照果皮的SOD活性均分别极显著高于接种果肉与对照果肉(p<0.01)。伽师瓜第24 d接种果皮的SOD活性峰值是86-1甜瓜第24 d接种果皮活性峰值的1.59倍,且差异极显著(p<0.01)。

2.4.4 对甜瓜果实CAT活性的影响 CAT具有将H2O2转化为H2O和O2的作用[25]。链格孢侵染伽师瓜第21、15 d,接种果皮与接种果肉的CAT活性达到峰值。第21 d接种果皮CAT活性峰值是第15 d接种果肉活性峰值的3.09倍,且差异极显著(p<0.01)(图8A)。

链格孢侵染86-1甜瓜第18、21 d,接种果皮与接种果肉的CAT活性达到峰值。第18 d接种果皮CAT活性峰值是第21 d接种果肉活性峰值的3.14倍,且差异极显著(p<0.01)(图8B)。

图8 链格孢侵染对伽师瓜(A) 和86-1甜瓜(B)CAT活性的影响Fig.8 Effects of A. alternata infection on CAT activity of Jiashi(A)and 86-1 muskmelon(B)fruit

在贮藏期间,两种甜瓜果皮与果肉的CAT活性整体呈现先升高后下降的变化趋势,接种组果皮与果肉的CAT活性均分别显著高于对照组果皮与果肉(p<0.05),接种组与对照组果皮的CAT活性分别极显著高于接种组与对照组果肉(p<0.01)。伽师瓜第21 d接种果皮与第15 d接种果肉的CAT活性峰值分别是86-1甜瓜第18 d接种果皮与第21 d接种果肉的1.47、1.49倍,且差异极显著(p<0.01)。链格孢菌侵染引起甜瓜果实酶活性的变化规律与1-MCP处理对桃果实采后病害的研究结果一致[26]。

3 结论