牛大肠杆菌病灭活疫苗的制备及小鼠攻毒试验分析

赫鸣睿

摘要：近年来关于规模化牛场犊牛腹泻的报道日渐增多，大肠杆菌是引起犊牛腹泻最常见的病原体。本研究对发病牛分离得到的大肠杆菌菌株进行生化试验、PCR鉴定、动物致病性试验、细菌灭活、疫苗制备、小鼠免疫和攻毒保护试验。PCR结果表明大肠杆菌JS160810含有毒力基因F41、Sta、K99，大肠杆菌ZD150808含有毒力基因irp2、FyuA、Stxl，动物致病性试验结果表明都具有很强致病性。小鼠的最佳免疫剂量为1.5×10¹⁰CFU。攻毒保护结果氢氧化铝胶佐剂疫苗的保护率为80%，说明疫苗能产生良好的免疫应答。为今后进行田间试验提供了理论依据，并将为防治牛大肠杆菌病提供一种保护范围更加全面的生物制品。

关键词：多价疫苗;犊牛;腹泻;强致病性;大肠杆菌病

中图分类号：S855.1⁺2 文献标识码：A 文章编号：2095-9737（2018）10-0023-03

犊牛腹泻常由于肠道内的细菌、病毒等病原微生物或者营养、环境等因素所致。其中致病性大肠杆菌是犊牛腹泻发病的最主要因素之一[1-2]。导致犊牛腹泻的大肠杆菌毒力因子主要有肠毒素和菌毛黏附素等。犊牛大肠杆菌病有着较高的发病率及死亡率，而且还会继发感染其他疾病。因为大肠杆菌拥有血清型众多、细菌变异性大、抗原复杂等特点，并且不同地区流行的血清型菌株之间又存在着很大的差别[3]。抗生素在大肠杆菌病预防及治疗方面有着积极作用，但是随着抗生素的使用不当，大肠杆菌耐药谱和耐药水平不断提高，大肠杆菌多重耐药现象已十分严重。如今新型抗生素不断问世，但抗生素的研制速度远远低于耐药菌的发展速度。外界环境对细菌作出刺激后，细菌会大量产生毒力因子，这些因子的功能各不相同，在细菌致病的过程中起到重要作用。目前，国内外先后出现了很多种相应预防犊牛腹泻的试验性疫苗，其中包含以抗黏附素免疫为基础的含单价或多价黏附素抗原的灭活全菌苗、基因工程亚单位疫苗等。然而因为大肠杆菌的血清型比较多，各地分离菌株携带的毒力因子及生物学特性又有所不同，使得疫苗的应用受到很大限制，至今还没有普遍应用的预防犊牛大肠杆菌腹泻的商品化菌苗[4]。因此，按照不同地区致病性大肠杆菌的优势血清型研制出真正有效的灭活疫苗具有现实的生产意义[5]。

1 材料

大肠杆菌JS160810、ZD150808分别从齐齐哈尔市和肇东市某奶牛场发病犊牛分离并保存。试验动物为18～22g昆明系小鼠购自北京维通利华动物有限公司。蜂胶佐剂和氢氧化铝胶佐剂由本实验室保存;革兰氏染色液购自安徽省巢湖市弘慈医疗器械有限公司;改良Minca肉汤、营养琼脂、伊红美蓝凯琼脂等均购自青岛高科园海博生物技术有限公司;生化试验管购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

2 方法

2.1 菌液制备及镜检

将菌种材料分别在无菌环境下用细菌接种环接种于伊红美蓝培养基上再放置于37℃恒温箱内培养24h后观察结果。挑取伊红美蓝培养基上生长的单个菌落将细菌涂在载玻片上干燥后进行革兰氏染色，并用显微镜进行镜检观察。分别挑取伊红美蓝培养基上各菌种的单个菌落接种于改良Minca肉汤中放入37℃空气浴摇床中进行细菌增殖培养16h做疫苗菌液。

2.2 细菌生化鉴定

无菌环境下使用接种环挑取各菌种单个菌落纯培养物分别接种到蔗糖、麦芽糖、鼠李糖、甘露糖、木糖、甘露醇、糊精、肌醇、葡萄糖、半乳糖、乳糖、山梨醇、果糖、明胶、葡萄糖磷酸盐溶液、蛋白胨水等生化管中37℃培养24h后，观察结果并记录。

2.3 大肠杆菌毒力因子PCR鉴定

煮沸法提取细菌DNA：取100μL菌液于洁净的EP管中，再在管中加入100μL磷酸盐缓冲溶液（PBS）进行混合，将EP管至于高速离心机12000r/min离心3min，弃掉上清，按上述步骤用PBS对菌液进行洗涤2～3次，洗涤后将EP管至于100℃沸水中水浴20min，12000r/min离心15min，吸上清于4℃冰箱保存，作为模板DNA。

PCR反应体系：上游引物（10μM）0.5μL，下游引物（10μM）0.5μL、模板DNA1μL、TaqMasterMix（5u/μL）12.5μL，补水至总体积为25μL。反应程序：94℃预变性5min;94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环;72℃终延伸5min。反应结束后，PCR产物加入1%琼凝胶用紫外凝胶成像系统观察并拍照保存。

2.4 大肠杆菌半数致死量（LD₅₀）的测定

将JS160810、ZD150808各菌株菌液分别稀释至1.0×10⁹CFU/mL、1.0×10⁸CFU/mL、1.0×10⁷CFU/mL、1.0×10⁶CFU/mL、1.0×10⁵CFU/mL、1.0×10⁴CFU/mL、1.0×10³CFU/mL、1.0×10²CFU/mL、1.0×10¹CFU/mL的菌数分别腹腔注射小鼠，同时设生理鹽水的对照组，共注射190只小鼠，随机分成19组，每组10只小鼠，每只0.2mL，同时设生理盐水的对照组，在注射后第1-7天不同时间段对小鼠进行观察。

2.5 疫苗制备

将菌株JS160810和菌株ZD150808菌液利用甲醛溶液进行灭活，甲醛溶液的终浓度为0.15%，将含有甲醛的菌液放置37℃空气浴摇床中培养24h进行灭活，将灭活后的菌液分别接种在普通营养琼脂培养基和改良Minca肉汤中，37℃培养48h检查菌液灭活效果。将完全灭活的菌液进行浓缩后与氢氧化铝胶佐剂4：1混合，放入4℃冰箱保存，浓缩后疫苗含菌量为3×10¹⁰CFU/mL。

2.6 疫苗的安全性检验

将制备好的疫苗接种于伊红美蓝琼脂平板和改良Min-ca肉汤培养基中，37℃培养2天，观察有无细菌生长。取10只小自鼠，分别皮下注射疫苗，0.5mL/只;观察10天，记录食欲及精神状态。

本实验共分成四组进行免疫，分别是Group1（免疫剂量3.0×10⁹CFU/只）;Group2（免疫剂量9.0×10⁹CFU/只）;Group3（免疫剂量1.5×10¹⁰CFU/只）;氢氧化铝胶佐剂对照组（Control 0.1mL/只），每组20只小白鼠共计80只小白鼠，采用皮下多点注射，共免疫3次，免疫间隔时间为21天。Group1、Group2、Group3、Control每組各取10只小鼠进行重新分组，分成两个攻毒组每组40只小鼠，用2×LD₅₀活菌液ZD150808和2×LD₅₀活菌液JS160810对两个攻毒组分别攻毒，攻毒时间为三次免疫结束后第10天，攻毒后观察7天内小鼠的发病及死亡情况。

3 结果与分析

3.1 疫苗的无菌及安全性检验结果

结果均无任何微生物生长。小鼠接种10天后全部健康存活，注射氢氧化铝胶佐剂疫苗的小鼠注射部位皮肤上有肿块，无化脓现象。

3.2 细菌镜检结果

细菌为两端钝圆的革兰氏阴性短小杆菌，个别菌体可呈近似椭圆形，多单独或成对存在，不形成芽胞符合大肠杆菌形态特异性

3.3 生化试验结果

这两株菌均符合大肠杆菌的生化特性，具体结果见表2。

3.4 PCR检测结果

JS160810大肠杆菌F41、Sta、K99基因分别在431bp、314bp、163bp处有清晰条带，与预期目的片段大小相符，见图1。ZD150808大肠杆菌irp2、fyuA、Stx1基因分别在953bp、531bp、301bp处有清晰条带，与预期目的片段大小相符，见图2。

3.5 大肠杆菌半数致死量检测结果

大肠杆菌JS160810的LD₅₀为1.78×10⁵CFU，大肠杆菌ZD150808的LD₅₀为2.51×10⁵CFU。

3.6 最佳免疫剂量确定及攻毒保护试验结果

以大肠杆菌JS160810攻毒后Group1在7天内死亡6只小鼠Group2在7天内死亡4只小鼠Group3在7天内死亡2只小鼠，以大肠杆菌ZD150808攻毒后，Group1在7天内死亡7只小鼠，Group2在7天内死亡6只小鼠Group3在7天内死亡2只小鼠，Gro叩3中小鼠存活率都很高，且保护率均为80%。

4 讨论

该病一年四季均可发生，犊牛和羔羊多发于冬、春舍饲期间[6-7]。一旦发生，病死率很高，有的甚至能够达到100%;牛、羊发病时一般呈散发性或地方流行性。大肠杆菌肠毒素的类型分为耐热型肠毒素（ST）和不耐热肠毒素（LT）两类，将它们制成双联苗后，可以抵抗各类产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）感染[8]。一般来说，动物源性的ETEC菌株只产生ST[9]。据调查，引起犊牛、羔羊腹泻的ETEC黏附素中 K99和F41相加占50%以上[10]。本试验利用从黑龙江省部分市区腹泻犊牛的病料中分离、筛选出的2株致病性大肠杆菌菌株，研制出牛大肠杆菌病灭活苗，病料采集范围广泛，涵盖黑龙江地区各主要规模化养牛场，分离的菌株具有一定的代表性和普遍性，这些都为针对地区流行的牛大肠杆菌病疫苗的研制奠定了良好基础，经动物实验证明研制出的地方株大肠杆菌病灭活苗具备较好的保护效果。研究表明，改良Minca肉汤培养的抗原所制备的免疫血清效价高，抗体维持时间长[11]。这是由于液体培养条件下菌株的各种生物学性状得到充分表达。因此，本试验采用了液体培养法对疫苗抗原进行培养。要全面有效地控制大肠杆菌病，在采用疫苗免疫的同时还应采取综合性防治措施，加强饲养管理，提高犊牛抗体水平和减少应激等。

参考文献：

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