HPLC梯度洗脱测定黄芪叶中鼠李柠檬素葡萄糖苷的含量

【摘 要】 目的：建立HPLC梯度洗脱测定黄芪叶中量大成分鼠李柠檬素3-O-β-D-葡萄糖苷的含量。方法：HPLC法；色谱柱：Diamonsil-C18（5?m， 4.6nm×250nm）；流动相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脱（0～45min， 10%A→85%A），流速1.0mL·min-1，检测波长266.9nm，柱温25℃。结果：鼠李柠檬素3-O-β-D-葡萄糖苷在2.1～33.0?g范围内呈良好线性关系（r = 0.9999），平均加样回收率（n=9）99.3%，RSD=1.35%；6批黄芪叶中鼠李柠檬素3-O-β-D-葡萄糖苷平均含量为0.44%。结论：该方法准确、简单、具有良好的重复性和稳定性，为黄芪叶质量控制提供了科学的依据。

【关键词】 黄芪叶；含量测定

黄芪叶具有良好的抗炎、抗肿瘤、抗病毒、能有效的保护肝脏，降血糖等作用[1]。叶中主要含黄酮和皂苷类成分[2]。本文建立了黄芪叶中鼠李柠檬素3-O-β-D-葡萄糖苷含量测定方法，并比较6个批次黄芪叶鼠李柠檬素3-O-β-D-葡萄糖苷的含量，为评价黄芪叶的质量控制和综合开发利用提供了科学依据。

1 实验仪器、材料和试剂

1.1仪器

Waters 2695型高效液相色谱仪，四元梯度泵，2996型PDA检测器；梅特勒AL204天平（Mettler-Toledo Group）；梅特勒AB265-S天平（Mettler-Toledo Group）。

1.2试药

鼠李柠檬素3-O-β-D-葡萄糖苷由实验室自制，结构经MS、IR和NMR确证，HPLC （峰面积归一化法）纯度>98.5%；甲醇（色谱纯，Dikma公司）；水为超纯水；其余试剂为分析纯。

黄芪叶于2010年采集于黑龙江省大兴安岭，经黑龙江中医药大学王振月教授鉴定为膜荚黄芪的干燥叶。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的配制

精密称取对照品鼠李柠檬素3-O-β-D-葡萄糖苷4.13mg置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并加至刻度，摇匀，配制成0.413mg/mL鼠李柠檬素3-O-β-D-葡萄糖苷的对照品液。

2.2 供试品溶液的制备

取黄芪叶，粉碎，过4号筛，精密称取约2.0g，置圆底烧瓶中，精密加甲醇50mL，称定重量，加热回流4个小时，放冷，再称定重量，甲醇补足减少的重量，混匀，滤过，精密取续滤液25ml，收干溶剂，残渣加甲醇溶解，转移至10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即为供试品。

2.3 色谱条件

色谱柱：Diamonsil-C18（5?m， 4.6nm×250nm）；流动相：甲醇（A） -水（B），梯度洗脱（0～45min， 10%A→85%A），流速1.0mL·min-1，检测波长266.9nm，柱温25℃。理论塔板数按鼠李柠檬素3-O-β-D-葡萄糖苷计算，不低于6000。对照品与样品的色谱图见图1。

2.4 标准曲线制作

分别精密吸取“2.3”项下对照品溶液5、10、20、40、80?L，注入高效液相色谱仪，测定。以峰面积Y对进样量X进行线性回归，获得回归方程Y=3000000X-750318，r=0.9999，表明鼠李柠檬素3-O-β-D-葡萄糖苷在2.1～33.0?g时呈良好的线性关系。

2.5 精密度

精密吸取对照品10μL，按“2.3”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，结果鼠李柠檬素3-O-β-D-葡萄糖苷RSD=0.98%。说明精密度高。

2.6 重复性

精密称取同一批次供试品黄芪叶约2.0g共6份，按“2.2”项下方法平行制备供试品溶液，按“2.3”项色谱条件进样10μL，测定。记录峰面积，结果鼠李柠檬素3-O-β-D-葡萄糖苷含量的平均值为4.39mg/g，RSD=1.3%。说明此方法重复性良好。

2.7 稳定性

取“2.2”项下供试品溶液，室温放置0，2，4，12，18，24 h后，按“2.3”项色谱条件进行HPLC分析，记录峰面积，结果RSD（n=6）为1.12%，结果表明供试品溶液在24h内稳定。

2.8 加样回收率试验

精密称取鼠李柠檬素3-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，置5ml容量瓶中，配成浓度为2.21mg/ml的对照品储备液，精密称取同一批次的黄芪叶样品约0.5g，共9份，根据样品中含鼠李柠檬素3-O-β-D-葡萄糖苷量的50%，100%，150%，分别向样品中加入2.21mg/ml对照品液0.5，1.0，1.5mL，各3份，按“2.2”项下方法制备供试溶液，照“2.3”项下色谱条件进样分析，测定，计算加样回收率平均值为99.3%（n=9），RSD为1.35%。

2.9 样品含量测定

分别取6个批次的黄芪叶，按“2.2”项制备供试品溶液，各3份，按“2.3”项色谱条件进行HPLC分析，进样量10?L，记录峰面积，结果见表1。

参考文献

[1] 黄贤荣， 梁爱君， 黄忠， 等. 黄芪茎叶药理作用研究进展[J]. 解放军药学学报， 2012， 28（3）：264-270.

[2] 陈虎虎， 龚苏晓， 张铁军， 等. 黄芪茎、叶的化学成分和药理作用研究进展[J]. 药学评价研究， 2011， 34（2）：134-137.

通訊作者：马振平， 女（汉族）， 硕士，药师