大型海藻组织培养研究进展

徐睿航 张国庚

[摘 要] 本文首先对大型海藻的组织培养历史研究成果进行介绍，然后分析海藻组织培养存在的问题，最后从培养方法、取材、培养基、生长条件等方面对海藻组织培养的相关技术及相关研究进行总结。

[关键词] 大型海藻；组织培养；取材；培养基；生长条件

[中图分类号] Q943.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-7909（2018）05-89-3

海藻在海洋植物中占有很重要的地位，而大型海藻是海藻中非常重要的组成部分，主要的经济大型藻类包括红藻、绿藻、褐藻等多个门类。大多数藻类的经济价值较高，可以用作食品、一些药物的原料，也可用作动物饲料等，甚至是可以提炼工业原料，如角叉胶、琼脂、早酸盐、卡拉胶等。尽管我国在海藻研究方面人数较少且起步相对比较晚，但是在经济海藻的应用研究方面如紫菜体细胞育苗上已经达到国际领先水平[1]。为了有效提高海藻作物的产量，要尽快实现海藻组织培养的产业化，突破海藻组织培养的瓶颈，快速生产市场上缺少的商品苗。

1 历史研究情况

20世纪50年代，海藻组织培养的研究开始兴起。1952年，Aharon Gibor开始着手对囊链藻Cystoseira组织培养进行研究[2]。二十世纪七八十年代，海藻组织培养技术发展比较迅猛。1978年，有学者运用无菌培养技术对皱波角叉菜（Chondrus crispus）髓部组织进行培养，并获取其愈伤组织诱导分化形成完整植株，取得不小的研究成果[3]。20世紀80年代，植物组织培养发展最为迅速，很多研究人员相继通过海藻组织培养得到相应的孢子体。20世纪末，随着分子生物学与细胞生物学的不断发展，海藻组织培养技术因此也增加了许多鉴定及分析方法，对其有着极大的影响。同样，随着固定化技术、基因工程、细胞杂交等一系列生物技术的发展，藻类生物技术同样飞快进步着。羊栖菜（Sarqassum fusiforme）假根育苗等技术也为藻类育苗提供了新的方法[4，5]。

2 海藻组织培养存在的问题

现在的主要问题是对控制海藻细胞成长与分化等方面知识较缺乏，导致很难控制组织、细胞愈合组织或细胞的发育。并且截至目前，依然无法得到合适的、准确的海藻培养基。

另外，早期组织培养的问题是无菌材料的获取，无法有效获取无菌组织导致在培养过程中细菌快速生长而抑制藻类组织的生长，甚至会杀死培养组织。截至目前，大型海藻的无菌取材、操作及培养仍是一个难以跨越的瓶颈。在无菌条件下培养的藻类，多数个体最终都不能正常生长，其中最易发生的情况就是植株发育畸形。但是，如果在培养过程中加入某些被分离的细菌或其他污染物时，藻类恢复正常生长。这说明在那些被分离的污染物中包含能使藻类正常生长的物质，但目前还没有成功分离出相应的物质，并且对这些物质的鉴定也并不完全成熟[6]。

3 相关技术研究

3.1 培养方法

大型海藻的组织培养主要是培养大型海藻生活史中的微观阶段，如配子、配子体和孢子等。根据培养目的的不同，可以将培养方法分为以下三类：一是粗培养，就是在培养过程中将多种藻混在一起进行培养，并且包含细菌的培养；二是单藻培养，即在培养过程中仅存在一种藻类，但是单藻培养过程中培养基中会含有细菌；三是无菌培养，即在培养过程中只培养一种藻，并且没有细菌污染[7]。

3.2 取材

3.2.1 取材部位。在组织培养过程中，其生长活力或者产生的愈伤组织的不同，有很大一部分原因是培养的组织块的取材位置不同。因此，选择比较合理、准确的培养材料是非常重要和必要的。1977年，Saga等[8]在海带的叶片、假根、茎的切段再生试验中，发现有再生能力的部位仅仅是离基部较近的一段区域（包括柄和假根）。方宗熙等[9]对海带和裙带菜孢子体两者不同部位的再生能力进行了试验，结果发现双方皆是叶片基部切块经愈伤组织长出的孢子体的数量最多，其次是叶片中部。而对于羊栖菜芽生苗出苗率而言，最高的是假根，之后是主干中上部，最后是下部[9]。不同部位的组织块生长发育状况不同的现象同样出现于条斑紫菜离体组织再生苗的研究试验中[10]。同样，鼠尾藻不同部位的分生能力也是各不相同，其中最强的是固着器的外植体，其次则是主茎，而枝与叶的形态发生活性很差[11]。

3.2.2 灭菌处理。灭菌的程度就是既要杀灭外植体所带的细菌，又不能对外植体有所损害。常用的消毒试剂如表1所示。

3.3 培养基的制备

3.3.1 培养基的种类。培养基是根据材料和培养目的的不同来选择的，高等植物的培养基主要有MS培养基（Murashige和Skoog，1962）、ER培养基（Eriksson，1965）、B5培养基（Gambor等，1968）、SH培养基（Shenk和Hildebrandt，1972）和HE培养基（Heller，1953）。而海藻与高等植物有一定的区别，故在培养基的选择上也有所不同，主要有培养褐藻的PESI培养基、MES培养基、PES培养基、VAS培养基，其中PES培养基主要培养红藻和绿藻，还有就是Erd（-shreiher）培养基和ESS培养基，这两种培养基主要用于培养一般海藻。这些培养基在组成成分上是有所不同的。除了化学成分外，培养基的物理因素在培养过程中所造成的影响也是不能忽视的。比如，固体培养基对于诱导愈伤组织的形成是比较有利的，而细胞和胚状体的增殖则在液体培养基中更容易进行。

3.3.2 植物激素。培养基中除了那些必不可少的营养物质外，其他植物生长调节剂及其他植物激素也尤为重要。植物激素的添加在藻类组织培养中一直是个难题。对于大型海藻的组织培养而言，植物激素对其愈伤组织的分化以及后期植株的形成与发育都是十分重要的。一般细胞分裂素对于诱导细胞脱分化形成愈伤组织是非常有利的，较高的细胞分裂素与生长素之比有益于芽的形成，较高的生长素和细胞分裂素之比有利于根的形成。但是，由于植物激素与组织分化之间的相互作用和植物基因的遗传表达有着非常紧密的关系，所以有时甚至会出现相反的结果。研究表明，多胺类、油菜素甾醇类、三十烷醇等化合物也具有植物生长调节剂活性[12]。

另外，激素的种类和浓度的不同对海藻组织块的发育和生长同样有着不同的影响。比如，6-BA和2，4-D在条斑紫菜组织培养过程中的作用就不同[13]。吲哚乙酸和脱落酸在海带中不同部位不同时期的分布对其生长发育有着不同的影响，对此，李铁松对其关系进行了研究测定[14]。

3.4 生长条件

培养条件的不同对之后培养的过程及结果会有很大的影响。一是光照条件。通常应用日光灯，一般光照强度控制在15～40 μmol/（m2·s），每天的光照时间在12～16 h。二是温度条件。不同的植物体在自然环境中所适合的温度不同，要根据不同植物体在自然环境中所适宜的生长温度来适当调整培养温度，通常在15～25 ℃。三是湿度条件。不仅仅是培养容器中的湿度对培养有影响，培养环境的湿度对培养也有影响，所以要同时注意这两方面的湿度条件。四是充气条件。在液体培养基中，培养时可以通过充气的方式来达到搅拌培养的效果。在通入空气时，要对通入的空气进行加工，需要经过滤膜孔径为0.22 μm的过滤装置，以此来保证培养过程无菌。此外，可以利用硫酸铜溶液去除其他藻类和杂菌，以避免培养过程被污染。五是培养液的更换。要根据培养要求及培养对象的不同按规定更换适量的培养液。需要注意的是，海水培养液由于蒸发的原因会使盐度有所增加，因此，应根据蒸发量每天定量补加蒸馏水。例如，1997年Saga等[15]用海带藻体分别进行假根、茎、叶片切段再生试验，结果表明只有在靠近基部（包括假根、柄）部分才有再生能力。培养条件为用PESI培养液培养，光照周期为10L∶14D，温度为10 ℃，光照强度30 μmol/（m2·s）。

4 结语

虽然目前海洋组织培养在组织块的无菌培养及植物生长调节剂的研究方面存在不足，但在海藻组织培养领域已经取得了不小的成就。随着今后基因工程、细胞杂交、固定化等技术的发展和成熟，对藻类的组织培养是很有利的，对藻类的育苗、快速繁殖、相应活性物质的提取研究及产业化生产都是十分可观的。总之，藻类组织培养技术在今后一定会得到更加广泛的应用。

参考文献

[1]徐礼根，阮积惠，徐程，等.海洋植物组织和细胞培养研究进展[J].海洋学研究，1999（2）：1-9.

[2]何培民，秦松，严小军，等.海藻生物技术及其应用[M].北京：化学工业出版社，2007.

[3]吴融.海藻生物技术的现状和前景[J].海洋科学，1992（2）：27-30.

[4]徐礼根，阮积惠，徐程，等.海洋植物组织和细胞培养研究进展[J].东海海洋，1999（2）：9.

[5]刘杰，韩晓弟，汤银川，等.海洋植物组织培养技术研究进展[J].安徽農业科学，2009（19）：8860-8862.

[6]王志勇.鹧鸪菜组织和细胞培养的研究Ⅳ.藻体任意碎片的培养与损伤藻体再生的观察[J].海洋湖沼通报，1991（1）：66-72.

[7]何培民，秦松，严小军，等.海藻生物技术及其应用[M].北京：化学工业出版社，2007.

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[9]方宗熙，阎祚美，王宗诚.海带和裙带菜组织培养的初步观察[J].科学通报，1982（11）：690-691.

[10]梅俊学，费修绠.条斑紫菜离体组织再生苗的研究[J].海洋科学，2000（6）：39-42.

[11]董栋.鼠尾藻组织培养的初步研究[D].青岛：中国海洋大学，2007.

[12]侯和胜，吴超元.藻类中植物激素的研究进展[J].海洋科学集刊，1998（40）：167-176.

[13]王萍，王丹丹，藤亚娟，等.激素对条斑紫菜叶状体离体培养的影响[J].江苏农业科学，2007（4）：173-175.

[14]李铁松.海带中两种植物激素的分离及其活性研究[D].大连：大连理工大学，2008.

[15]Saga N，Uchida T，SskaiY. CloneLam inaria frum simgle isolated cell[J].Bull. Japanese Soc. Phyeol.，1978（44）：87.