双启动子调控β-半乳糖苷酶基因表达载体的构建及表征分析

赵海丽 吕素芳

摘要： 本试验的目的是扩增得到β-半乳糖苷酶基因启动子序列和β-半乳糖苷酶基因并反向插入pET32a载体中，构建穿梭质粒表达载体，并进行诱导表达，分析β-半乳糖苷酶基因在双启动子序列调控下的表达特征。

关键词： 大肠杆菌;β-半乳糖苷酶基因;表达载体

中图分类号： Q756    文献标识码： A    文章编号： 1672-9129（2018）09-0078-01

Abstract：  the purpose of this study was to obtain the expression characteristics of the lion-galactosidase gene promoter sequence and the lion-galactosidase gene through the reverse insertion of the pET32a vector， construct the shuttle plasmid expression vector， and conduct the induced expression， and analyze the expression characteristics of the lion-galactosidase gene under the regulation of the double promoter sequence.

Keywords： escherichia coli;β-Galactosidase gene;Expression vector

β-半乳糖苷酶，又称β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，广泛存在于各种动物﹑植物及微生物中。β-半乳糖苷酶能催化β-半乳糖苷化合物中的β-半乳糖苷键发生水解，还具有转半乳糖苷的作用。由于它具有糖苷键结构特异性，可作为乳糖降解和双糖合成催化剂，并具有水解生物体内储存的多糖和半乳糖残基，引起血型转化等生理功能[1]，而受到人们广泛关注，成为生物化学和酶催化化学的重要研究课题。β-半乳糖苷酶的应用有着悠久的历史，最初在食品工业中用来降解乳糖含量以满足乳糖不耐症症状患者的需要，随着生物技术的发展，它越来越多的应用于生物技术、化学、医药等领域。

1 材料与方法

1.1实验材料。

（1）菌株和克隆载体 猪大肠杆菌987P（登记号C83710）菌种，pET32a 载体。

（2）工具酶与试剂盒 各种限制性内切酶（NheⅠ、XbaⅠ）、dNTP、PCR Buffer 、Taq DNA聚合酶、RNAase、 DL15000、DL2000、IPTG均购自TaKaRa生物公司;DNA回收试剂盒购自大连宝生物工程（大连）有限公司。其他生化试剂均为化学分析纯。

1.2实验方法

（1）总DNA的快速提取 挑取单菌落到1.5ml离心管内，加20μl双蒸水后混匀，95℃水浴10min，-20℃10min，于4℃、12000rpm离心2min，取上清备用。

（2）β-半乳糖苷酶基因的PCR扩增 反应体系：模板1 μl，10×PCR buffer2.5μl，dNTP 3μl，上、下游引物各1μl，Taq DNA聚合酶 0.5μl，ddH2O 16μl。反应条件为95℃预变性4 min，94℃变性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸3 min，35个循环，最后延伸10min。取5μl PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

（3） PCR产物及pET32a双酶切、回收、连接、转化及鉴定：参照分子克隆。

（4） 重组表达载体的诱导及SDS-PAGE检测：常规操作。

（5）表达产物的划线鉴定 利用涂布36μL 20mg/ml X-gal，34μL 24mg/ml IPTG LB固体选择培养基和涂布36μL 20mg/ml X-gal固体选择培养基进行。

2 结果与分析

2.1 β-半乳糖酶苷基因的PCR 挑取987P细菌进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定后在3064bp处有明亮条带，为目的条带，说明扩增成功。大量扩增后进行酶切回收。

2.2 重组质粒的菌落PCR鉴定及双酶切鉴定 经连接转化后，随机挑取白色菌落进行PCR扩增。结果均扩增出3064bp大小目的片段，选取两个菌落进行大量培养，提取质粒进行Nhe Ⅰ、Xba Ⅰ双酶切后，出现一条5900bp载体片段和一条3064bp目的片段，均为阳性重组子，表明重组质粒构建成功，可以进行诱导表达。

2.3 重组表达载体的诱导 选取阳性重组质粒进行活化培养，按1/100接种于LB液体培养基培养，对数期时加入IPTG诱导，在不同时期取样进行电泳检测，结果证明表达成功，在120 KD左右为目的蛋白，诱导时间不同对于β-半乳糖苷酶表达量影响不大。

2.4 表达产物的划线鉴定 将阳性重组质粒培养液划线接种于涂布X-gal， IPTGLB固体选择培养基和涂布X-gal固体选择培养基，设空白对照，37℃温箱中培养过夜，得到菌株;在含有X-gal和诱导物IPTG（A）的培养基上菌株形成明显的蓝色菌落;在只含有X-gal的培养基（B）中形成不明顯的蓝色菌落。结果表明：阳性菌株均能在含有IPTG诱导物的情况下高效表达β-半乳糖苷酶，在不存在IPTG诱导物的情况下三株野生菌株只产生少量的β-半乳糖苷酶。

3 讨论

目前分子生物学与基因克隆工作中，常以耐药性基因作为克隆筛选的标记，其优点是可以对克隆转化子进行正向筛选，而且可使含耐药性基因的质粒在抗生素存在的情况下保持稳定。然而其缺点是显而易见的，在农业和食品工业中应用的菌株，如果含有位于质粒上的耐药性基因，有可能造成耐药性基因的扩散，而以非抗生素抗性为选择标记的载体系统可以克服以上不足[3]。β-半乳糖酶基因是细菌的持家基因和营养因子，所以β-半乳糖苷酶基因也可以作为质粒载体稳定表达的选择标记，这在减少畜产品中的药物残留以及保护微生态环境均具有重要的意义。这样不但赋予了β-半乳糖酶基因的新用途，更使质粒达到了“食品级”的要求，从而更加广泛的应用于畜牧生产与人类保健。

参考文献：

[1]王春凤，秦泽荣，孙哲，等.以ThyA基因为选择压力非抗性质粒载体的构建.微生物学通报.2001，28（2）：42—46

[3]孙哲，王春凤，汪明.大肠杆菌β-半乳糖酶苷基因缺陷型菌珠的筛选.中国兽医杂志.2004.40（2）：12—14