中学生物植物类实验中染色剂的应用及优化

董文焕　祝妍瑾　陈文荣

摘 要 对中学生物教材中涉及到的植物类实验材料所使用的经典的染色剂，如碘液、斐林试剂、苏丹III染液、吡罗红甲基绿染色剂、龙胆紫染液和健那绿染液等，进行了归纳总结，旨在为教材中所涉及的植物类实验中的染色剂的应用及优化提供一些研究和思考的方向。

关键词 中学生物 染色剂 应用 优化

中图分类号 G633.91 文献标志码 B

中学生物学教材中包含了许多探究性、验证性和设计类实验等，其中许多植物类实验中涉及到组织、细胞染色剂，而且不少教材上的染色方法存在着效果不理想等问题。下面通过文献综述并结合实验室的实践，对中学阶段植物类实验的染色剂及使用方法进行总结并对染色方法进行优化改进，以提高实验效果和效率，真正引导学生勤思考、勤动脑，学以致用，进行相应的实验方法的迁移教育。

1 碘液

碘液是中学生物实验室最常用的染色剂之一。例如，观察人的口腔上皮细胞、观察洋葱内表皮细胞、观察酵母菌细胞、观察玉米种子的结构、探究影响酶活性的条件、探究植物的光合作用以及革兰氏染色等实验中都用到碘液。

受到传统实验方法和试剂材料的局限，观察植物表皮细胞这一实验教学实践中一直使用碘液进行染色，实验教学缺少创新，染色效果单一且有些观察效果不佳。笔者以洋葱鳞片叶表皮为材料进行了大量的实验，建议从有机試剂（如碱性品红、亚甲基蓝、固绿、苏木精等）和无机染料[如体积分数为24.5%H2SO4、饱和Fe2（SO4）3溶液、饱和CuSO4溶液、物质量浓度为0.5 mol/L的Li2SO4溶液等]进行单染色和交互染色，以取得更好的染色效果，以求丰富植物细胞染色色系，并为中学实验教学提供更多的染色方法及更为丰富的染色效果。

碘液在中学生物实验中，还广泛用于淀粉的鉴定。在该实验中，取2 mL含淀粉的生物组织匀浆的上清液，加入2～3滴碘—碘化钾溶液，可以将该样品染成蓝色，原理是淀粉遇碘变蓝色。需要注意的是若使用其他富含淀粉的材料进行实验时，有的材料遇淀粉不显蓝色，而显紫色，也是正常现象，这是由于实验材料中的支链淀粉与碘液发生了紫色的显色反应。

在验证酶的专一性的实验中，常用淀粉酶来催化淀粉水解，而对实验结果的验证都采用淀粉遇碘变蓝这一颜色反应。一般是将一定量可溶性淀粉溶液加入试管，调至实验所需的温度和pH条件下，加入淀粉酶，保温5～10 min，最后向试管中滴加碘液。关于碘液的滴加顺序，有学者提出了不同的观点。曹志强做了验证试验，并提出了“先加碘液效果更好”的观点，认为其现象明显，能观察到反应前与反应后颜色变化情况，更增强了对比效果。但田久沛等人经过研究对其进行了纠正，认为在进行淀粉酶的性质实验时，碘液应最后加入，而不能在加入淀粉酶之前加入。其理由如下：一方面，若提前加入，一方面会由于I2的氧化性而使淀粉酶性质发生改变；另一方面，碘与淀粉生成的蓝色复合物在加热时会消失，影响对淀粉水解进程的判断。若混合液体的温度较高，还应取出试管，待冷却后再加入碘液，防止碘在较高温度下升华。

2 斐林试剂

斐林试剂是由物质量浓度为0.1 g/mL的NaOH溶液（甲液）和0.05 g/mL的CuSO4溶液（乙液）组成的，与可溶性还原糖（葡萄糖、果糖和麦芽糖）在加热的条件下，能够生成砖红色的氧化亚铜沉淀。但是要注意斐林试剂的甲、乙液要单独配置和贮存且混合后应立即使用，特别在室温高于35℃的环境中，碱性新制氢氧化铜悬浊液中的Cu（OH）2将在较短时间内分解成黑色CuO沉淀从而影响还原糖的检测。

针对鉴定还原糖实验中，斐林试剂的甲、乙溶液是否要混合均匀后才能注入这一问题，有不少研究对此进行了研究探讨。韩萍为此进行了实验设计，结果发现甲、乙液混合与不混合差别不是很大，都为砖红色，凭肉眼根本无法区分，因此，她认为在实验过程中甲、乙液的加入顺序无严格要求。郭卫华对其进行了改进，提出斐林试剂的使用顺序对实验结果有一定影响，但都能出现砖红色沉淀，可能是待测液中的有机酸会中和一些NaOH，使产生的Cu（OH）2不足，所以先加甲液，后加乙液的试管中砖红色沉淀会少些。

在还原糖的鉴定中，本尼迪特试剂对斐林试剂进行改良而得到被广泛用来替代斐林试剂。经验证，在染色效果上有很好的优势。理论上甘油铜也可替代斐林试剂，还有待进一步的证实和研究。

3 苏丹染液

苏丹染液是一种脂溶性染料，它和脂质有比较强的亲和力，所以当含有脂肪的标本与苏丹染液接触时，苏丹染料便从染液中转移到含脂肪的结构中，使脂肪显色。脂肪能被苏丹Ⅲ染液染成橘黄色。用苏丹染料鉴定脂肪时，实验所用花生种子材料，必须提前3～4 h浸泡。浸泡时间过短，不易切成薄片；浸泡时间过长，组织太软，切下的薄片又不易成形。但是在实际的操作中，徒手切片对于中学生来说有很大的难度，切除的切片往往厚薄不一，导致在镜下观察不到被染成橘黄色的脂肪颗粒。经过文献阅读以及实验和验证，笔者发现撕片法、模仿血涂片法、敲击压片法、花生泥法、酒精灯加热摩擦法均可以取得良好的效果，且苏丹Ⅳ染液染色效果优于苏丹Ⅲ染液。

在脂类物质的鉴定中，也可以从染色剂方面加以改善，建议使用苏丹Ⅳ染液，脂肪遇苏丹Ⅳ变为橘红色。理论上苏丹黑染液或油红O染液也可以替代苏丹Ⅲ染液。苏丹黑是一种脂溶性染料，可溶解于细胞浆内的含脂结构中，使胞浆中的脂类物质呈棕黑色或深黑色颗粒；油红O属于偶氮染料，是很强的脂溶剂和染脂剂，与甘油三酯结合呈小脂滴状，使组织内的脂滴呈橘红色。

4 吡罗红甲基绿染色剂

吡罗红-甲基绿染色剂在人教版高中生物《必修1·分子与细胞》中“观察DNA和RNA在细胞中的分布”的实验中发挥着极其重要的作用，使用该染料时应注意要现配现用。由于DNA主要分布在细胞核内，RNA大部分存在于细胞质中，碱性染料甲基绿、吡罗红对DNA和RNA的亲和力不同，甲基绿使DNA呈现绿色，而吡罗红使RNA呈现红色。所以利用甲基绿-吡罗红混合染色剂将细胞染色，可以显示DNA和RNA在细胞中的分布。

在实验材料上，教材中介绍了人的口腔上皮细胞，此外也提出了可用其他动物或植物细胞代替，大多数有关研究都提倡采用洋葱内表皮细胞代替口腔上皮细胞。在染液配方上，有以下两种改进方案：李晓聪对A液的配制进行了改进，由教材中的取吡罗红-甲基绿粉1 g进行溶解，改为取甲基绿2 g、吡罗红5 g分别进行溶解后再混合的方案，并通过大量的重复试验进一步探索了染液浓度对实验的影响，结果证明将配制的染液稀释到原浓度的1/6时，实验效果较稳定，重复性好；吴志强则先用氯仿对甲基绿提纯3～4次再进行配置，通过多次调试与对比实验发现，质量分数为1.5%的甲基绿和2%的吡罗红以5∶1的比例混合配置所形成的染色剂染色效果最好，且能在棕色瓶中密封保存一周。

5 龙胆紫溶液

染色体容易被碱性或酸性染液着色，龙胆紫是一种混合的碱性染料可以将染色体（质）染成深蓝色，因此可以作为检测染色体的物质。“观察植物根尖组织细胞的有丝分裂”是中学生物中难于操作又易失败的实验，其中龙胆紫染色要注意时间的把握，不宜太长或太短，否则会导致很难看清细胞中染色体的变化情况，都会影响实验效果。关于染色液的浓度有不少学者提出了改进，大致有以下两种方案：质量分数为0.3%龙胆紫液染色3～5 min，或质量分数为1%龙胆紫液染色1 min。也有研究验证，龙胆紫染液按照染色对象有不同的配制方法，效果更好。

除了用龙胆紫溶液外，也可以用醋酸洋红溶液、Schiff试剂、Giemsa染液或改良苯酚品红溶液来替代龙胆紫溶液。在日常实验教学中，如果仅作临时装片来观察，可以采用孚尔根染色、吕氏碱性蓝染色法、番红染色法、结晶紫或龙胆紫染色法、醋酸洋红染色法、番红染色法。而要制作永久装片，区分比较细胞有丝分裂和减数分裂各个时期和染色体组型分析，建议采用改良苯酚品红染色法或 Giemsa染色法。

6 健那绿染液

健那绿B是专一性染线粒体的活体染料，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使健那绿B染料始终保持氧化状态（即有色状态）呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中的健那绿B则被还原，呈现无色的状态。

教材中建议制作人口腔上皮细胞临时装片来观察线粒体，但取材过程要求较高，有时可能观察不到细胞。大多数学者建议采用洋葱内表皮细胞作为实验材料，洋葱细胞活性比较强，线粒体数量多，易观察。其次，取材时从洋葱内部（之前不切开）取无色透明内表皮，少有细菌干扰。也有研究认为大白菜是代替口腔上皮细胞最理想的植物材料，葱次之。教材中健那绿染液的配法，染料往往溶解不够完全，染色完成后常有不少的染料颗粒沉积于标本上，影响实验观察。因此建议将配制质量分数为1%的健那绿B溶液用滤纸过滤，作为原液；临用前用生理盐水稀释50倍用于实验。这样既减少染料颗粒的形成，又节约实验成本。目前，有实践进一步证明质量分数在0.4%～0.8%之间时染色效果最佳。

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