乌药提取物对伴刀豆凝集素A致免疫性肝损伤小鼠保护作用的研究

潘建强 彭 昕

1 浙江省德清县人民医院 浙江 德清 313200

2 浙江医药高等专科学校 浙江 宁波 315100

免疫性肝损伤是由免疫反应介导的肝实质炎症性病变，其重要特征是血清自身抗体阳性，肝组织内有大量的炎症细胞浸润，从而导致肝脏损伤。免疫性肝损伤是肝纤维化、肝硬化甚至肝癌等肝脏疾病转归和发生发展的诱发因素。因此，积极治疗免疫性肝损伤有着十分重要的意义。乌药是一味具有行气止痛、温肾散寒功效的传统中药，近年来有研究发现，乌药提取物可减轻急性酒精性肝损伤[1-2]。本文利用伴刀豆凝集素A（ConA）所致小鼠免疫性肝损伤模型，探讨其对免疫性肝损伤的潜在功效，为拓展其临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂：联苯双酯滴丸购自浙江医药股份有限公司新昌制药厂；伴刀豆凝集素A（ConA）购于美国Sigma公司；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、考马斯亮蓝试剂盒、丙二醛（MDA）检测试剂盒均购自宁波航景生物科技有限公司；苏木素伊红（HE）染色试剂盒、BCA蛋白质浓度测定试剂盒均购自碧云天生物科技公司；肿瘤坏死因子（TNF-α）酶联免疫吸附测定试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。

1.2 实验动物：60只昆明种雄性SPF级小鼠，鼠龄7～8周，体重18±3g，购自上海斯莱克实验动物有限公司。每日12h照明，标准饲料，自由饮水。保持饲养室温、湿度分别为：25±2℃、（55±5）%。

1.3 药品制备：乌药药材由浙江省天台山乌药生物工程有限公司提供，经鉴定为樟科（Lauraceae）山胡椒属（Lindera）植物乌药Lindera aggregate（Sims）Kosterm的干燥块根。将干燥乌药药材粉碎，称取10g，分别用200、100ml的80%乙醇超声提取2次，每次60min，合并两次提取液，减压旋转浓缩至20ml，使提取液的浓度按生药计为0.5g/ml。小鼠灌胃量10、5、1ml/kg则分别制得高、中、低剂量（按生药计为5.0、2.5、0.5g/kg）。给药剂量参考成人临床常规用量确定。

1.4 分组与给药：60只小鼠按每组10只，随机分为6组，Ⅰ组为对照组（空白），Ⅱ组为肝损伤模型组，Ⅲ组为联苯双酯阳性药物对照组，Ⅳ～Ⅵ组分别为乌药低、中、高剂量治疗组。连续给药10天，每日1次，对照组和模型组灌胃给予等量生理盐水，阳性药物组给予联苯双酯溶液（0.10g/kg），低、中、高剂量组分别给予相应浓度的提取物，末次给药后4h造模，除对照组外，其他各组小鼠尾静脉注射ConA 25mg/kg诱导ConA免疫性肝损伤模型[3]。

1.5 检测指标测定：造模8h后小鼠眼静脉丛取血，全血在4℃、5000r/min，离心5min，取上层血清置4℃贮存备用，检测血清中ALT、AST、TNF-α活性。摘眼球取血后处死小鼠，并迅速分离肝、脾，称取质量，计算小鼠的肝脏指数和脾脏指数。小鼠肝脏指数=（肝质量/体质量）×100%，小鼠脾脏指数=（脾质量/体质量）×100%。取相同部位大小约0.3cm×0.3cm×0.3cm的肝组织，经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，HE染色，显微镜下比较各组病理组织的形态学变化差异；并采用比色法检测肝组织匀浆中SOD、MDA的活性和含量。

1.6 统计学方法：采用SPSS17.0软件进行统计学分析，各组数据以-x±s表示结果。组间采用One-way ANOVA方差分析，差异显著水平为P＜0.05。

2 结果

2.1 乌药提取物对免疫性肝损伤小鼠肝脏、脾脏指数的影响：除对照组外，经ConA诱导的其它各组小鼠肝脏出现不同程度的损伤，其中模型组的肝损伤最明显，整肝呈现颗粒状，与对照组相比，肝、脾明显肿大，肝脾指数显著升高（P＜0.05），其它各组的肝表面均有大小不同的坏死斑，表明造模成功。乌药各剂量给药组均能够降低肝脾指数，中、高剂量组效果均达显著水平（P＜0.05）。其中高剂量组抑制肝脏指数增大的效果与阳性药物联苯双酯组相似，说明乌药提取物能抑制肝脏、脾脏的增大，且呈一定的剂量相关性。见表1。

2.2 乌药提取物对小鼠急性免疫性肝损伤肝组织病理学变化的影响：HE染色可见正常组小鼠肝脏组织细胞形态正常，未见明显病理损伤，肝索及肝血窦排列规则，无炎性细胞浸润。模型组肝小叶结构模糊，肝索结构消失，会管区有大量炎性细胞浸润，肝细胞扩张并含有大量红细胞，脂滴空泡，可见点状坏死及小灶状坏死。阳性药物组和各给药组均能不同程度地减轻肝脏受损程度。高剂量组肝索基本呈放射状排列，肝窦结构较清晰，肝小叶结构基本正常，肝细胞肿胀及炎性细胞浸润与模型组相比有明显改善。见图1。

图1 各组HE染色肝脏病理观察（×40）

2.3 乌药提取物对肝损伤小鼠血清相关指标的影响：见表2。

表2 乌药提取物对肝损伤小鼠血清相关指标的影响（-x±s）

3 讨论

ConA致小鼠肝损伤是常用的免疫性肝损伤模型。ConA主要效应细胞有辅助性T细胞（Th）和巨噬细胞，进入体内后可激活肝窦内的大量巨噬细胞产生细胞因子直接损伤肝细胞，大量活化的T淋巴细胞可随血流到达肝脏，或激活巨噬细胞使血管内皮细胞被破坏，最终导致免疫性肝损伤[4]。MDA是自由基损伤机体不饱和脂肪酸形成的脂质过氧化产物，其含量高低往往与机体和细胞的受损程度成正比。SOD是机体抗氧化体系中起重要作用的一种含金属离子酶，可通过催化超氧自由基的歧化反应清除活性氧自由基，保护细胞膜结构与功能完整性。由肝巨噬细胞分泌的TNF-α可诱导肝细胞凋亡，并诱导多个调节免疫和炎症过程的基因转录，是参与免疫性肝损伤的重要因素之一。ALT和AST是分布在肝细胞质内的可溶性酶，肝脏受损后便释放入血，因此血清ALT和AST水平高低常作为判定肝损伤程度的重要指标。

本研究结果表明，乌药各剂量给药组均能够降低肝、脾指数，中、高剂量组可使血清ALT、AST水平显著降低，且变化趋势与给药浓度成正比。各剂量组的MDA和

TNF-α水平都显著下降，高剂量组还可显著提高SOD活性（P＜0.05），说明其可以通过提高肝细胞中抗氧化酶活性，抑制肝细胞发生脂质过氧化等来降低免疫性肝损伤小鼠氧化应激程度，从而改善肝损伤情况。由此可见，乌药对ConA所致的免疫性肝损伤有较好的拮抗作用，为乌药保肝药效的进一步开发利用奠定了相关实验基础。

4 参考文献

[1]季梦漂，谭明明，王军伟，等.乌药不同提取物对急性酒精性肝损伤小鼠肠推进率的影响[J].浙江中医杂志，2017，52（9）：700-701.

[2]陈卓亮，王军伟，谭明明，等.乌药水提物与醇提物对急性酒精性肝损伤模型大鼠抗氧化作用的比较研究[J].浙江中医杂志，2015，50（6）：414-415.

[3]郑丹丹，姜楠，胡扬扬，等.双孢菇胞内和胞外多糖对伴刀豆凝集素A诱导免疫性肝损伤小鼠的保护作用[J].中国药理学与毒理学杂志，2017，31（4）：303-310.

[4]马静，姚广涛.保肝药效筛选方法及中药保肝的研究进展[J].医学综述，2016，22（23）：4671-4675.