膜增生性肾小球肾炎样病变免疫荧光分类法改良的探讨

李长，朱双，黄朝兴

（1.温州医科大学附属第一医院 肾内科，浙江 温州 325015；2.温州医科大学附属苍南医院 肾内科，浙江 温州 325800）

膜增生性肾小球肾炎（membranoproliferative glomerulonephritis，MPGN）是一种少见的慢性肾炎。传统上，根据电子致密物沉积的部位把原发性MPGN分为I型、II型和III型三种超微病理类型，其中的II型即致密物沉积病（dense deposit disease，DDD）现已被划归C3肾小球病（C3 glomerulopathy，C3G）[1]。经典的特发性MPGN-I型为免疫复合物（immune-complex，IC）性肾炎，以内皮下IC沉积为特征；而C3G的发病机制是补体旁路途径的异常活化。2011年SETHI和FERVENZA提出MPGN免疫荧光（immunofluorescence，IF）新分型[2]，基于发病机制及考虑肾活检组织IF检查是否存在各种免疫球蛋白（immunoglobulins，Igs）及补体C3，把MPGN分为Ig介导和补体介导两型，前者指IC性MPGN，后者指可表现为MPGN的C3G，包括DDD和C3肾小球肾炎（C3 glomerulonephritis，C3GN）。MPGN样病变是指在光学显微镜下具有与MPGN的病变相似的一组肾小球损伤模式，病因多源化[3]，其特征主要是肾小球基底膜重复（“双轨”形成）和系膜增宽（结节分叶状）。根据MPGN的IF新分型可把MPGN样病变分为Ig介导、C3介导及非免疫介导三类[4]，这有助于其病因鉴别。

2015年COOK等[5]提出一个包含更多发病机制的MPGN新分型：①Ig相关性MPGN；②C3沉积为主的MPGN；③特发性MPGN（非C3G或Ig相关性）。晚近，对补体旁路途径异常活化的疾病谱及单克隆丙种球蛋白病（monoclonal gammopathy，MG）相关性肾损害的疾病谱有了新认识[6-8]。因此，有必要探讨对MPGN样病变的IF分类（以下简称IF分类法）进行改良。本研究以温州医科大学附属第一医院1994年1月至2018年4月间肾活检诊断的118例MPGN样病变为对象，采用我们在IF分类法基础上探索的改良IF分类（以下简称改良IF分类法）结合电镜检查及临床进行回顾性病因分析，现报告如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取1994年1月至2018年4月间温州医科大学附属第一医院肾脏病理室肾活检诊断为MPGN样病变的病例共118例。所有入组者要求符合以下3条标准：①光镜下呈MPGN样病变，伴或不伴系膜区和内皮下沉积物；②行IF检查，伴或不伴电镜检查；③临床和病理资料较完整。排除标准：①由于临床病理资料不完整，不足以鉴别病因；②IF检查：无肾小球，又未做免疫组织化学检测。本研究经本院伦理委员会批准。

1.2 临床病理资料的收集 从医院住院病历的电子数据库收集患者肾活检时年龄、性别、起病的诱因、病程、浮肿、血压、血尿、尿蛋白、尿轻链、血浆白蛋白、血轻链、血清肌酐、血清免疫球蛋白、补体、血清蛋白电泳、血清免疫固相电泳、ANA/ENA系列、ANCA系列、冷球蛋白、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染标志物和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染标志物等临床数据资料。从温州医科大学附属第一医院肾脏病理室的肾活检电子数据库收集患者的肾活检资料，包括病理、免疫病理和超微病理检查及其诊断报告。

1.3 病理学检查 全部病例均在超声引导下经皮肾穿刺获得肾组织，取得样本常规在石蜡包埋组织切片上行HE、PAS、PASM和Masson染色，在冰冻切片上行直接IF法检查IgG、IgA、IgM、补体C3、C1q和纤维蛋白原，间接IF法检查HBsAg和HBcAg；部分病例做了IgG亚型（IgG1、IgG2、IgG3和IgG4）、补体C4、轻链κ和λ的IF检查。部分病例做了电镜检查。

1.4 病理诊断标准 肾小球疾病病理诊断参照1995年WHO修订的肾小球疾病病理学分类标准[9]，本研究把IgA肾病（IgA nephropathy，IgAN）归为原发性肾小球疾病，已排除继发性病因如过敏性紫癜、肝硬化、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）和HBV感染等；HBV相关性肾炎（HBV associated glomerulonephritis，HBVGN）的诊断参照国内肾活检病理诊断标准指导意见[10]；C3G的诊断标准按照国际肾脏病协会（2013年）C3G会议专家共识[11]；有肾脏意义的单克隆丙种球蛋白病（monoclonal gammopathy of renal significance，MGRS）指与意义未明的单克隆丙种球蛋白病（monoclonal gammopathy of undetermined significance，MGUS）相关的肾脏病，有别于MGUS[8]。

1.5 IF分类法的改良 IF分类法[4]模式图见图1。

图1 MPGN样病变的IF分类法

我们对IF分类法做如下的改良：①把MPGN样病变按IF检查分为“多克隆免疫球蛋白（polyclonal immunoglobulins，PIgs）（+）及C3（+）”“单克隆丙种球蛋白（monoclonal immunoglobulin，MIg）（+）及C3（+）或（-）”“C3（+）及Igs（-）”和“Igs（-）及C3（-）”四大类，分别对应IC介导、MIg相关、C3G及非免疫介导等四个主分类；②把原来隐藏在“Ig介导”分支下的“IC介导”提出并将其独立成为主分类之一，与其他几个主分类处于平行位置；③把原为“Ig介导”病因之一的“MG”改称“MIg相关”，且提升其位置并将其独立成为主分类之一，与其他几个主分类处于平行位置；④把特发性MPGN归类于“IC介导”。改良IF分类法的模式图见图2。

1.6 MPGN样病变的病因分析 采用改良IF分类法及电镜检查并结合临床资料和病理资料的分析，对所有入组对象的MPGN样病变病因行回顾性再鉴别。特发性MPGN的诊断除了要排除C3G、MIg相关MPGN、非免疫介导的MPGN样病变以外，还要排除继发于感染、自身免疫疾病等系统性疾病以及继发于IgAN的MPGN。

图2 MPGN样病变的改良IF分类法

2 结果

2.1 MPGN样病变的一般资料 符合入组条件的MPGN样病变共118例，其中男45例，女73例；年龄4～80岁，平均（39.8±17.2）岁，其中特发性MPGN 12例，而同期肾活检总数9 738例，特发性MPGN占同期肾活检总数的0.12%。

2.2 MPGN样病变的病因与改良IF分类法 118例MPGN样病变按改良IF分类法分为：IC介导MPGN占78.8%（93/118），C3G占8.5%（10/118），MIg相关MPGN占5.9%（7/118），非免疫介导的MPGN样病变占6.8%（8/118）；病因分类：特发性MPGN占10.2%（12/118），有继发性病因的病例占89.8%（106/118）；继发性病因以SLE最常见，占34.7%（41/118），其次是HBV感染占12.7%（15/118），见表1。

改良IF分类法与IF分类法的病因鉴别作用比较：由表1可见，例a和例b如果采用IF分类法可导致漏诊MG相关性C3G，而改良IF分类法可避免其漏诊，这2例按改良IF分类法实际应归类于“MIg相关”；例c因C3G的IF诊断标准局限性不管采用哪种IF分类法均可导致漏诊DDD，该例实际应归类于“补体介导”或“C3G”；例d和例e均因IF检查局限性，不管采取哪种IF分类法均可分别漏诊纤维样肾小球病和胶原III肾小球病，这2例实际应归类于“非免疫介导”。如果采用IF分类法的总漏诊率将为4.2%（5/118），而采用改良IF分类法的总漏诊率则降低为2.5%（3/118）。

2.3 MPGN样病变的病因与电镜检查及MPGN的超微病理分型 MPGN样病变118例，其中77例做了超微病理检查。77例MPGN样病变，其中MPGN 73例，MPGN样病变4例。4例MPGN样病变包括溶血尿毒综合征（hemolytic uremic syndrome，HUS）2例，纤维样肾小球病和胶原III肾小球病各1例。MPGN 73例，其中特发性MPGN 12例，占16.4%；继发性MPGN 61例，占83.6%，继发病因主要是SLE占32.9%（24/73），其次是IgAN和HBV感染，分别占15.1%（11/73）和11.0%（8/73）。MPGN超微病理分型最常见是I型，占56.2%（41/73），其次是III型41.1%（30/73）和II型2.7%（2/73）；在I型和III型，继发性MPGN分别占78.1%（32/41）和90%（27/30）；见表2。

表1 118例MPGN样病变病因与改良IF分类法[例（%)]

电镜检查及MPGN的超微病理分型对病因鉴别作用的评估：确诊DDD 2例、纤维样肾小球病和胶原III肾小球病各1例，合计4例；对IF分类的修正诊断率（修正诊断总例数/检查总例数）为5.2%（4/77）。

3 讨论

MPGN样病变仅是光镜下的一种病变，不是一种疾病，但涵盖了多种病因。疾病分类法包括病因分类、形态学分类和发病机制分类三种。传统的MPGN超微病理分型仅反映了形态学的不同，而IF分类法[4]按照MPGN发病机制对MPGN样病变进行病因分类，后者的意义是可根据MPGN的不同发病机制和病因进行有针对性临床干预和研究。

一个好的分类法在病因鉴别程序上的设计也要具有实用性。晚近认识到补体旁路途径异常活化的疾病谱除了C3G以外，还可包括不典型HUS、MG相关性肾脏病及原发性MPGN-I型等[4，6-7]；这就要求在把C3G归类前，必须先鉴别这些疾病。在IF分类法，由于“MG”处于主分类“Ig介导”之下，即并不处于与另一主分类“补体介导”平行的位置，将不利于鉴别这类疾病中存在补体旁路途径异常活化的病例。本研究提示，如果采用IF分类法可能因符合C3G的IF诊断标准仅诊断C3G，而漏诊实际为MG相关性C3G的病例。MG相关性肾脏病也可罕见于不典型HUS[6]，IF分类法在病因鉴别程序的上述缺陷同样可能导致这样的病例漏诊。

表2 73例MPGN病因与超微病理分型（例）

免疫荧光呈Igs和C3共沉积的MPGN被SETHI和FERVENZA称为IC介导的MPGN，其很大部分病例临床表现为内源性或外源性抗原血症及循环免疫复合物水平升高，导致抗原-抗体复合物沉积于肾小球；肾脏内IC沉积可激活补体经典途径，通常导致肾小球内补体C1q、C4与C3共沉积；这些病例的主要病因是自身免疫病和慢性感染。混合性冷球蛋白血症可见于IC介导MPGN，但其复合物是在IgG和IgM之间形成。

MG是MPGN的一个常见的重要病因。MG相关性肾脏病可通过MIg沉积（直接机制）或通过MIg激活补体旁路途径（间接机制）所致[6]。由MG引起的副蛋白血症可导致MIg伴或不伴C3沉积于肾小球，这并不是严格意义上的IC介导疾病，称之为“MIg相关”可能更适合。

改良IF分类法把MPGN样病变分为IC介导、MIg相关、C3G及非免疫介导四个主分类，可使MPGN样病变的病因鉴别程序发生改变。其中一个特点是把“MIg相关”独立成为一个主分类，且与其他主分类处于平行位置，这就要求各主分类先相互鉴别后归类，于是可以避免漏诊MG相关性C3G的病例。

MG的临床疾病谱包括MGUS、华氏巨球蛋白血症、淋巴增生性疾病和多发性骨髓瘤。MG相关性肾脏病的病理表现可包括增生性肾炎伴MIg沉积、免疫触须样肾小球病、纤维样肾小球病、淀粉样变、MIg沉积病、C3G和HUS[6]。本研究显示，MIg相关性MPGN在临床上可表现为MGRS（包括增生性肾炎伴MIg沉积和MG相关性C3GN）、华氏巨球蛋白血症、B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤。在2016年美国梅奥诊所和肾脏病理协会提出的按病因和发病机制对肾小球肾炎进行的新分类[12]里，把“IC介导”与“MIg相关”这两类分开，此做法值得借鉴。MIg相关性MPGN的病因特殊，在诊断MGRS之前，要先排除恶性浆细胞病和淋巴增生性疾病等。改良IF分类法把“MIg相关”独立出来可更有利于鉴别其病因和采取针对性治疗。

改良IF分类法的另一特点是把“IC介导”也独立成为一个主分类，使特发性MPGN得以归属，并使其鉴别诊断程序变得更清晰。经典的MPGN-I型是特发性MPGN的代表，主要沉积多克隆IgG和C3，并常伴IgM、C1q和C4，为IC介导及通过经典途径激活补体。在鉴别诊断程序上首先要排除MIg相关性MPGN和C3G；其次是鉴别IC介导MPGN的继发性病因，这主要是自身免疫病和感染。本组MPGN样病变最常见为IC介导MPGN，继发性病因主要是SLE和HBV感染，与上海瑞金医院报道[13]MPGN（该研究入组对象排除了SLE和HUS）的继发性病因以HBV感染为主的结果相似，而在国外导致MPGN的主要病毒感染原是HCV[4]。值得注意是，IgAN在本组MPGN样病变中的比例为9.3%，这提示IC介导的MPGN也可由补体旁路途径激活所致；但国外罕见MPGN继发于IgAN[14]。近年认识到MPGN可继发于以IgA沉积为主的感染相关性肾炎，在诊断IgAN时需要鉴别之。鉴于本研究对象积累的年份跨度较大及属回顾性研究等局限性，IgAN的占比有可能被高估。

诊断特发性MPGN必须很谨慎。随着对MPGN发病机制和病因的不断认识，现认为特发性MPGN已很少见，其在MPGN样病变中的占比低于10%[15]。温州医科大学附属第一医院从1994年到2018年的24年间接受了温州地区所有医院的绝大部分肾活检样本共9 738例，其中特发性MPGN 12例，仅占同期肾活检总数的0.12%，这与近年国外特发性MPGN患病率低下的趋势一致[15]。在本组MPGN样病变中，特发性MPGN占比为10.2%，由于本研究存在上述局限性，其患病率有可能被高估。

MIg相关MPGN的诊断有赖于肾活检组织IgG亚型和轻链的免疫病理检查。LARSEN等[16]观察到常规的冰冻切片IF检查可出现MIg假阴性，而在石蜡包埋组织切片上行蛋白酶消化后的IF检查能检出MIg，从而可减少伴MIg沉积的MPGN约1/3病例的漏诊；强调对于存在MG临床证据的C3GN或IF阴性的MPGN（包括光镜或电镜下见冷球蛋白血症性肾炎的特征性病变）的病例均要行石蜡IF检查。在本研究中，1例MG相关C3G的诊断与补做石蜡IF有关。MIg相关MPGN在本组MPGN样病变病中占5.9%，考虑到本研究对象仅部分行IgG亚型和轻链的免疫病理检查，我们认为其患病率有可能被低估。

与IF分类法一样，改良IF分类法也存在IF检查固有的局限性。如C3G按照目前的IF诊断标准仍有20%漏诊率[11]，本研究中由于C3G诊断标准的局限性导致的C3G漏诊率为10%（1/10）；IF检查的局限性还可能导致漏诊纤维样肾小球病和胶原III肾小球病，这类疾病与DDD一样均依赖电镜诊断。本研究显示，电镜检查对IF检查的修正诊断率为5.2%。电镜通过明确电子致密物沉积及其定位可做出MPGN超微病理分型，并有助于鉴别HUS等非免疫介导的MPGN样病变[11]。

MPGN样病变的病因鉴别必须结合临床，如检查补体旁路途径调节蛋白（如H因子）有助于鉴别补体介导的MPGN，血清免疫固相电泳和游离轻链等检查有助于鉴别MG，等等。

综上所述，MPGN样病变的病因鉴别要以IF分类法为基础，并结合超微病理和临床。我们在IF分类法基础上探索的改良IF分类法可更好地认识MPGN样病变的发病机制及有助于其病因鉴别。IF分类法的改良值得进一步研究。